Entwicklung Aptamer-basierter Methoden zur Detektion und Aufreinigung rekombinanter Proteine in der Biotechnologie

• Applicant: Professor Dr. Thomas Scheper
• Subject Area: Biological Process Engineering
• Term: from 2009 to 2014
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 111595125

• Final Report Year: 2014

Final Report Abstract

Das Ziel des Projektes war es, Aptamer-basierte Verfahren zur Detektion und Aufreinigung verschiedener biotechnologisch relevanter Proteine bereitzustellen. Innerhalb des ersten Förderzeitraums konnte gezeigt werden, dass sich Aptamere für die Detektion von Proteinen mittels Microarrays eignen. Dabei konnten Aptamere gegen den His-Tag sowie innerhalb des Projektes selektierte Aptamere gegen das FC-Fragment humaner Antikörper erfolgreich als Detektionsmolekül in den drei verschiedenen Microarray Formaten (Forward Phase, Reverse Phase und Sandwich Assay) eingesetzt werden. Die Aptamere konnten darüber hinaus für die Aufreinigung von rekombinanten Proteinen verwendet werden. Dabei wurden zunächst Gruppenspezifische Aufreinigungsverfahren für His-getaggte Proteinen sowie Antikörper entwickelt. Diese ermöglichen die Proteinaufreiniung mit vergleichbarer Aufreinigungseffizienz wie die herkömmlicherweise verwendeten Methoden IMAC oder Protein A Affinitätschromatographie. Darüber hinaus weisen Aptamere als Affinitätsliganden weitere Vorteile auf, wie beispielsweise in der Target-Elution. So konnten Aptamere gegen das FC-Fragment humaner Antikörper entwickelt werden, die die Antikörperaufreinigung unter milderen Bedingungen erlauben als die typischerweise verwendete Protein A Affinitätschromatographie. Die Methode konnte erfolgreich auch auf weitere Aptamere, die gegen kleine Moleküle (Theophyllin, Ochratoxin A) gerichtet sind, übertragen werden. Innerhalb des Folgeprojektes wurden die Methoden zur Aptamer-basierten Detektion und Aufreinigung auf den humanen Wachstumsfaktor VEGF165 übertragen. Auch für dieses Protein gelang die Aufreinigung unter Verwendung milder Elutionsbedingungen auch aus komplexen Proben. Hinsichtlich der Detektion von VEGF wurden Aptamer-Microarrays entwickelt. Dabei zeigten sich insbesondere Reverse Phase Microarrays geeignet, um VEGF auch in komplexen Proben nachweisen zu können. Darüber hinaus wurde unter Verwendung von porösem Silizium als Transducer ein optischer Sensor zur markierungsfreien Detektion von VEGF getestet. Bei Detektion von VEGF wurde zudem die Hypothese untersucht, ob sich mit Hilfe von Aptameren auch Aussagen über die Konformation von VEGF treffen lassen. Hier konnte ein Aptamer identifiziert werden, dessen Bindung an VEGF über ein konformatives Epitop erfolgt und somit Rückschlüsse auf die Faltung des Proteins zulässt.

Publications

• Aptamere - Die Chemische Alternative zu Antikörpern; 28. Jahrestagung der Biotechnologen, 2010, Aachen
  Johanna-Gabriela Walter, Andreas Kage
  
• Aptamer-Based Downstream Processing of His-Tagged Proteins Utilizing Magnetic Beads; Biotechnology and Bioengineering 2011, Vol. 108, No. 10, 2371-2379
  Öznur Kökpinar, Johanna-Gabriela Walter, Yuval Shoham, Frank Stahl, Thomas Scheper
  
• Characterization of optimal aptamer microarray binding chemistry and spacer design; Chemical Engineering & Technology, 2011, Volume 34, Issue 12, pages 2022–2028
  Guohong Zhu, Miriam Lübbecke, Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
  
• Aptamers as affinity ligands for downstream processing; Engineering in Life Sciences, 2012, Volume 12, No. 5, 1-11
  Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
  
• Aptamers as detection molecules on reverse phase protein microarrays for the analysis of cell lysates; Engineering in Life Sciences, 2012, Volume 12, Issue 2, 2012, 144-151
  Miriam Lübbecke, Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
  
• Investigation of immobilized Aptamer-Protein Binding by Flow Cytometry; Acta Manilana, 2013, 61, 51-58
  Michael Meyer, Maren Lönne, Johanna-Gabriela Walter, Thomas Scheper
  
• Aptamer-based affinity purification of vascular endothelial growth factor; 34th International Symposium on the Separation of Proteins, Peptides and Polynucleotides (ISPPP) 2014, Würzburg
  Maren Lönne, Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
  
• Aptamers in Affinity Separations; 2014, Aptamers 2014, Oxford
  Johanna-Gabriela Walter, Guohong Zhu, Frank Stahl, Thomas Scheper
  
• Label-free optical biosensors based on aptamer-modified porous silicon scaffolds; Biosensors 2014, Melbourne, Australia
  Katharina Urmann, Johanna-Gabriela Walter, Esther Segal, Thomas Scheper
  
• Aptamer-Modified Magnetic Beads in Affinity Separation of Proteins; Methods in Molecular Biology. In: Reichelt S. (eds) Affinity Chromatography. Methods in Molecular Biology, vol 1286. Humana Press, New York, NY, 2015, pp 67-82. 978-1-4939-2446-2
  Guohong Zhu, Johanna-Gabriela Walter
  
• Development of an Aptamer-based Affinity Purification Method for Vascular Endothelial Growth Factor; Biotechnology Reports, Volume 8, December 2015, Pages 16-23
  Maren Lönne, Svenja Bolten, AntoninaLavrentieva, Frank Stahl, Thomas Scheper, Johanna-Gabriela Walter