HOCl-induzierte Lysophospholipidbildung aus Diacyl- und Alkenyl-Acyl-Phospholipiden
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Entzündliche Prozesse spielen bei vielen Erkrankungen eine große Rolle. Entzündungen sind auf molekularer Ebene durch das Einwandern typischer Entzündungszellen (z.B. neutrophiler Granulozyten) aus der Blutbahn in das Gewebe charakterisiert. Dabei werden bestimmte Enzyme wie z.B. Phospholipase A2 (PLA2) und reaktive Sauerstoffverbindungen („ROS“) wie z.B. HOCl generiert. Da Phospholipide (PL) in Zellen nicht nur die Zusammensetzung der Zellmembran darstellen, sondern auch an Signalübertragungskaskaden beteiligt sind, ist ihre (ROS-induzierte) Oxidation ein physiologisch bedeutsamer Prozess. Die Addition von HOCl an die ungesättigten Fettsäurereste von Phosphatidylcholin (PC) führt – genauso wie PLA2-Aktivität– letztendlich zur Bildung von Lysophosphatidylcholin (LPC). Lysophospholipide (LPL), insbesondere aber LPC, werden zunehmend als potentielle Biomarker für Krankheiten diskutiert. Da die gleichen PL bei unterschiedlichen Spezies vorkommen, sind LPL (im Unterschied zu Proteinen) universelle Biomarker. Im Mittelpunkt dieses Projektes standen deshalb Untersuchungen der Mechanismen der HOCl-induzierten Oxidation und LPL-Bildung. Weiterhin wurden auch Oxidationsprodukte untersucht, die durch andere Oxidantien bzw. enzymatische Prozesse gebildet wurden. Experimentell wurden die Oxidationsprodukte der PL in erster Linie mittels MALDI-TOF- (aber auch mittels ESI-) MS, TLC und 31P-NMR-Spektroskopie charakterisiert. Dabei spielte auch die Methodenentwicklung eine Rolle, wie z.B. für die „perfekte“ Matrix zur Detektion von Chloraminen und die direkte TLC-MALDI-TOF-MS-Kopplung. Es wurde nachgewiesen, dass PL, die neben den olefinischen Gruppen der Fettsäurereste keine weiteren reaktionsfähigen Gruppen besitzen (z.B. Phosphatidylglycerol und Phosphatidsäure) in analoger Weise wie PC die erwarteten LPL bilden. Für diese PL konnte gezeigt werden, dass der Sättigungsgrad die LPL-Bildung bestimmt und ein hoher Gehalt an Doppelbindungen die LPL-Ausbeute erhöht. Vergleichende Untersuchungen wurden mit Phosphatidylethanolamin (PE) durchgeführt, das eine Kopfgruppe besitzt, die selbst mit HOCl reagiert. Im Gegensatz zu den anderen PL ohne reaktive Kopfgruppe, bildet PE bei Reaktion mit HOCl nicht das erwartete LPE und könnte daher ein geeigneter Marker für die in vivo PLA2-Aktivität sein. Außerdem wurde untersucht wie die Position der Doppelbindungen oder das Vorliegen von cis/trans-Konfigurationsisomeren das Reaktionsverhalten von PL mit HOCl beeinflusst. Die trans-Isomere stellten sich dabei als weniger oxidationsempfindlich als die cis-Isomere heraus. Die LPC- Bildung war stärker ausgeprägt bei PC mit C18 (Δ6,9,12)-Fettsäuren in sn-2-Position als bei C18 (Δ9,12,15)-Fettsäuren. Überraschend war, dass der HOCl-Umsatz von Ölsäure (18:1) im Vergleich zu PC 18:0/18:1 zu mehr als sechs verschiedenen Verbindungen führte, die erhebliche Anteile von dimeren und trimeren Ether- und Ester-Verbindungen zeigten. Ein weiterer Schwerpunkt war die Untersuchung des Oxidationsverhalten von Alkenyl-PL („Plasmalogene“), da diese Verbindungen als besonders oxidationsempfindlich gelten und als „Scavenger“-Moleküle in der Literatur diskutiert werden. Die antioxidativen Eigenschaften der Plasmalogene stellten sich dabei als stark abhängig von den olefinischen Doppelbindungen in ihrer sn-2-Position und als eher intramolekular und nicht intermolekular protektiver Effekt dar. Schließlich wurde die in vivo-Relevanz der PL-Oxidationsprodukte anhand von klinisch relevanten Proben überprüft und in zahlreichen Zellen und Geweben konnte bei entzündlichen/ oxidativen Prozessen entweder eine LPC- oder die LPC- und LPE-Bildung nachgewiesen werden, weitere Oxidationsprodukte allerdings nie. Die gering konzentrierten oxidierten PL in komplexen biologischen Proben werden vermutlich mittels MALDI-TOF-MS ohne vorherige Trennung gar nicht und mit vorheriger TLC-Trennung nur schwer detektiert. Ein geeigneteres Verfahren hierfür stellt die hochauflösende LC-MS/MS dar, die in der letzten Förderperiode zur Detektion von PL-Hydroperoxiden zum Einsatz kam.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Lysophosphatidylethanolamine is - in contrast to -choline - generated under in vivo conditions exclusively by phospholipase A2 but not by hypochlorous acid. Biorg. Chem. 37 (2009) 202-210
Schober, C., Schiller, J., Pinker, F., Hengstler, J.G., Fuchs, B.
- Phosphatidylcholines and -ethanolamines can be easily mistaken in phospholipid mixtures: A negative ion MALDI-TOF MS study with 9-aminoacridine as matrix and egg yolk as selected example. Anal. Bioanal. Chem. 395 (2009) 2479-2487
Fuchs, B., Bischoff, A., Süß, R., Teuber, K., Schürenberg, M., Suckau, D., Schiller, J.
- HOCl-mediated glycerophosphocholine and glycerophosphoethanolamine generation from plasmalogens in phospholipid mixtures. Lipids 45 (2010) 37-51
Leßig J, Fuchs B
- Application of TLC to the analysis of lipids. J. Chromatogr. A., 1218 (2011) 2754-2774
Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J.
- Analysis of phospholipids and glycolipids by thin-layer chromatography-matrixassisted laser desorption and ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1259 (2012) 62-73
Fuchs, B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.chroma.2012.03.068) - A simple method to identify ether lipids in spermatozoa samples by MALDI-TOF mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 405 (2013) 6675-6682
Nimptsch, A., Fuchs, B., Süß, R., Zschörnig, K., Jakop, U., Schiller, J., Müller, K.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00216-013-7147-z) - Mass spectrometry and inflammation - MS methods to study oxidation and enzymeinduced changes of phospholipids. Anal. Bioanal. Chem. 406 (2014) 1291-1306
Fuchs, B
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00216-013-7534-5) - Stationary phase thickness determines the quality of thin-layer chromatography/matrix-assisted laser desorption and ionization mass spectra of lipids. Anal. Biochem. 451 (2014) 45-47
Griesinger, H., Fuchs, B., Süß, R., Matheis, K., Schulz, M., Schiller, J.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.ab.2014.02.002) - Analytical methods for (oxidized) plasmalogens - methodological aspects and applications. Free Radic. Res. 49 (2015), 599-617
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(Siehe online unter https://doi.org/10.3109/10715762.2014.999675) - Inflammation-associated changes in lipid composition and the organization of the erythrocyte membrane. BBA - Clinical 5 (2016) 186-192
Dinkla, S., van Eijk, L.T., Fuchs, B., Schiller, J., Joosten, I., Brock, R., Pickkers, P., Bosman, G.J.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.bbacli.2016.03.007) - Unexpected products of the hypochlorous acid-induced oxidation of oleic acid: A study using high performance thin-layer chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1439 (2016) 89-96
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Broniec, A., Zadlo, A., Pawlak, A., Fuchs, B., Klosinski, R., Thompson, D., Sarna, T.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2017.02.029)
