Coxsackievirus B3-induced modulation of K-channels in viral myocarditis associated arrhythmias

• Applicants: Professorin Dr. Karin Klingel; Professor Dr. Guiscard Seebohm
• Subject Area: Anatomy and Physiology ; Pathology
• Term: from 2009 to 2019
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 115937174

• Final Report Year: 2020

Final Report Abstract

Zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen der CVB3-Infektion von Kardiomyozyten, die aus iCell Cardiomyocytes differenziert wurden, erfolgte ein Vergleich mit anderen häufig auf diesem Forschungsgebiet verwendeten Zelllinien (HL-1, HeLa, H9c2). Es zeigte sich, dass lediglich iCell Cardiomyocytes zu nahezu 100% durch CVB3 infiziert werden und eine hohe virale Replikationrate aufweisen entsprechend der Befunde in Kardiomyozyten in vivo. Zudem zeigte der Vergleich von Markern (Caspase-1, Marker der Pyroptose und Caspase-3, Marker der Apoptose) hinsichtlich verschiedener Zelltodformen deutliche Unterschiede. Aktive Caspase-1 fand sich nach Infektion in HL-1 Zellen und H9c2 Zellen, jedoch nicht in HeLa Zellen oder iCell Cardiomyocytes. Aktive Caspase-3 wurde in infizierten HL-1 und HeLa Zellen, jedoch nicht in H9c2 Zellen oder iCell Cardiomyocytes nachgewiesen. Der Verlust der Zellmembranintegrität bei CVB3-infizierten iCell Cardiomyocytes legt jedoch nahe, dass sie durch programmierte Nekrose zugrunde gehen. Durch Inhibition sowohl von RIPK1 als auch von RIPK3 (beide Bestandteil des Nekrosoms) gelang eine Reduktion der viralen Replikation um etwa 50%. Die Analyse der RIPK1- und RIPK3-Expression auf Proteinebene zeigte, dass die RIPK3 Expression 8 h pi abnimmt und RIPK1 gespalten wird, die viralen Proteasen 2Apro oder 3Cpro für diese Spaltung aber nicht verantwortlich sind. Der Einsatz verschiedener Proteaseinhibitoren ergab zudem, dass die RIPK1-Spaltung weder durch den Einsatz von E64d, noch Pepstatin A oder Z-VAD- FMK unterdrückt werden kann. In einem Teilprojekt sollten pathophysiologische relevante Mechanismen potenziell letaler Arrhythmien bei CVB3-Infektionen in murinem Myokard und in CVB3-transgenen humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozten-artigen Zellen untersucht werden. Dazu wurden CVB3ΔVP0-Genome als nicht-infektiöse Transgene in Mäuse und iPSCs eingebracht. In der hieraus generierten CVB3ΔVP0-Mauslinie zeigte sich in MRT-Untersuchungen, dass diese Tiere eine systolische und diastolische Dysfunktion entwickeln. Isolierte CVB3ΔVP0-Kardiomyozyten zeigten eine Neigung zum Calcium overload und β–adrenerge Stimulation fördert eine Kalzium-Kontraktionsentkopplung in den CVB3ΔVP0- Kardiomyozyten. Da die CVB3ΔVP0-Mäuse ihr Transgen im Verlauf der Kreuzungen verloren, wurde das erste humane transgene RNA-Virus-Modell generiert. Es ließen sich funktionelle Kardiomyozyten aus dem CVB3ΔVP0-Klon herstellen, die ebenfalls eine β– adrenerge induzierte Kalzium-Kontraktionsentkopplung aufwiesen. Insbesondere das virale Nichtstrukturprotein 2A fungiert als Modulator für den KCNQ1/KCNE1-Kanal, welcher unter β-adrenerger Stimulation die korrekte Kalziumkonzentration in der späten Kontraktion kalibriert und Calcium overload verhindert. Vier KCNQ1/KCNE1-Modulatoren wurden auf ihre Pharmakologie untersucht. Ultrastrukturelle Untersuchungen und Transkriptom-/Proteom-Analysen zeigten, dass der kontraktive Apparat und die Energieversorgung durch CVB3 in Kardiomyozyten geschädigt werden. Diese hier aufgedeckten Veränderungen sorgen in beiden transgenen Systemen zu erhöhter Arrhythmieneigung und erklären CVB3-vermittelte Arrhythmien bei Patienten.

Publications

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