Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie ist eine wichtige Methode für die hochauflösende Abbildung einzelner, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierter Proteine. Durch den Eigenbau eines Einzelmolekülfluoreszenzmikroskops konnte ein Gerät entwickelt werden, das speziell den vorliegenden Bedürfnissen angepasst ist. So ermöglicht das Einkoppeln mehrerer Diodenlaser unterschiedlicher Wellenlänge im sichtbaren Spektralbereich und die Verwendung umschaltbarer optischer Elemente die Nutzung von „totalinternal-reflection fluorescence“ (TIRF) Mikroskopie mit bis zu drei Farben. Die Erweiterung durch einen durchstimmbaren Titan-Saphir Lasers erlaubt das selektive Anregen von Fluoreszenz im nahen Infrarotbereich, so wie das optische Fangen von Kohlenstoffnanoröhren. Ein wesentliches Anwendungsgebiet des Einzelmolekülfluoreszenzmikroskops war in den letzten 3 Jahren die Analyse der Motilitätseigenschaften von unterschiedlichen Kinesin Motorproteinen. Bei der Familie der Kinesine handelt es sich um Proteine, die an Mikrotubuli, ein Bestandteil des Zytoskeletts, binden und eine große Vielzahl von unterschiedlichen Aufgaben bewältigen. So sind sie für den Langstreckentransport wie auch für die Generierung zellulärer Kräfte verantwortlich. Darüber hinaus gibt es eine ganze Reihe von mitotischen Kinesinen die essentiell für die Zellteilung sind. In mehreren Publikationen so wie mehreren Abschlussarbeiten konnte ein wesentlicher Beitrag dazu geleistet werden, die seit Jahrzehnten bestehende Ansicht, Kinesin Proteine bewegen sich ausschließlich in einer bestimmten Bewegungsrichtung entlang der Mikrotubuli, zu widerlegen. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass individuelle Vertreter der Kinesin-5 Unterfamilie dazu in der Lage sind, ihre Bewegungsrichtung zu ändern. Den molekularen Mechanismus, der diese Richtungsänderung bewirkt zu finden und zu verstehen ist Bestandteil aktueller Forschungsarbeiten an dem Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop. Eine weitere Doktorarbeit beschäftigte sich mit der Multimerisation von Kinsein-3 Proteinen. Diese spielen eine wichtige Rolle im axonalen Transport von synaptischen Vesikeln wobei bisher nicht eindeutig geklärt war ob diese als Dimere, Trimere oder Multimere vorliegen. Mit Hilfe des Einzelmolekülfluoreszenzmikroskops konnte sowohl in vitro als auch in vivo in C. Elegans gezeigt werden, dass Kinesin-3 Unc-104 als Dimer vorliegt. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt ist die Verwendung von Kohlenstoffnanoröhren im Einzelmolekülfluoreszenzmikroskop. Aufgrund ihrer besonderen stabilen Fluoreszenzeigenschaften eignen sich diese besonders gut zur Markierung einzelner Moleküle. So ist es bisher gelungen, sowohl in vitro als auch in vivo Kohlenstoffnanoröhren an Kinesin Motorproteine zu binden und diese über lange Zeiträume in Zellen und in lebenden ganzen Organismen, C. elegans, im Mikroskop zu verfolgen. Das Ausnutzen der Polarisationseigenschaften der Kohlenstoffnanoröhren wird es dabei in Zukunft ermöglichen, auch die räumliche Orientierung der Proteine zu bestimmen. Weiterhin wird das Mikroskop dazu benutzt, mithilfe einer schnellen Videokamera die Fluktuationen von fluoreszierenden Kolloiden in Drosophila Embryonen zu verfolgen, um dadurch die viskolelastischen mechanischen Eigenschaften der Embryonen aufzuklären und gleichzeitig mechanische Nichtgleichgewichtsprozesse zu studieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2011: “Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry”. The EMBO Journal, 30: 4942-4954
Adina Gerson-Gurwitz, Christina Thiede, Natalia Movshovich, Vladimir Fridman, Maria Podolskaya, Tsafi Danieli, Stefan Lakämper, Dieter R. Klopfenstein, Christoph F. Schmidt and Larisa Gheber
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(2012) “Conformational state of monomeric kinesin UNC-104”. Dissertation, Georg-August-Universität Göttingen
Volker C. Henschel
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(2012) “Single-molecule experiments with mitotic motor proteins”. Dissertation, Georg-AugustUniversität Göttingen
Christina Thiede
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2012: “A chimeric Kinesin-1/Kinesin-5 microtubule-sliding motor switches between diffusive and processive motility“. Biophysical Journal, 104: 432-441
Christina Thiede, Stefan Lakämper, Alok D. Wessel, Stefanie Kramer and Christoph F. Schmidt
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2012: “Endoplasmic Reticulum Sorting and Kinesin-1 Command the Targeting of Axonal GABAS Receptors“. PLoS ONE, 7: e44168
Viviana Valdés, José Ignacio Valenzuela, Matías Jaureguiberry-Bravo, Daniela Salas, Carolina Otero, Christina Thiede, Christoph F. Schmidt and Andrés Couve
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2012: “Neck-Linker Length Dependence of Processive Kinesin-5 Motility”. Journal of Molecular Biology, 423: 159-168
André Düselder, Christina Thiede, Christoph F. Schmidt and Stefan Lakämper
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2012: “Regulation of bi-directional movement of single kinesin- 5 Cin8 molecules”. BioArchitecture, 2: 70-74
Christina Thiede, Vladimir Fridman, Adina Gerson-Gurwitz, Larisa Gheber and Christoph F. Schmidt
