P-Selectin Glykoprotein Ligand-1-unabhängige Mechanismen der Tissue factor-Aufnahme in Thrombozyten
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im geförderten DFG-Projekt konnten wir zunächst die endogene Expression von zwei verschieden großen P-Selectin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1) Varianten (PSGL-1[402] und PSGL-1[392]) auf mRNA Ebene in humanen glatten Gefäßmuskelzellen (SMC) erstmalig nachweisen. Die Klonierung der beiden Varianten ergab, dass sich die beiden Varianten durch die Anzahl an dekamerischen Repeats (10 Aminosäuren im translatierten Protein) unterschieden. Die lentivirale Überexpression beider Varianten in SMC bestätigte den Größenunterschied. Die überexprimierten PSGL-1 Varianten wurden funktionell an der Oberfläche von SMC exprimiert und banden FITC-markiertes P-Selectin. Um die physiologische Bedeutung von PSGL-1 in SMC zu untersuchen, wurde Thrombin als Expressionsstimulus gewählt. Humanes α-Thrombin war in der Lage, PSGL-1 mRNA- und Proteinexpression transient heraufzuregulieren. Dabei handelte es sich um die 402-Aminosäuren große PSGL-1 Variante. Das Protein wurde allerdings zytosolische exprimiert und gelangte nicht an die Zelloberfläche. Zur Oberflächenexpression von endogenem PSGL-1 war ein Ko-Stimulus notwendig. Durch den synergistischen Effekt eines Thromboxan A2- Mimetikums wurde PSGL-1 an die Oberfläche von SMC transloziert und konnte dort FITC-markiertes P-Selectin binden. Damit war PSGL-1 ein potenzieller Interaktionspartner für die Interaktion von Mikropartikeln (MP) aus SMC und Thrombozyten. Im zweiten Teilbereich des Projektes sollten die Transfermechansimen für Tissue factor (TF) zwischen a) MP aus SMC und Thrombozyten und b) MP aus monozytären Zellen und Thrombozyten mithilfe von Flag-marktiertem, überexprimertem TF untersucht werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich eine Überexpression von TF-Flag sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene und im funktionellen Assay nachweisen ließ. Diese Ergebnisse ließen sich durchflusszytometrisch jedoch nicht bestätigen. Insbesondere der durchflusszytometrische Nachweis der TF-Flag-Expression auf den isolierten Mikropartikeln ist aber zur Untersuchung der Übertragung von TF auf Thrombozyten essenziell. Ein zuverlässiger Nachweis der Expression des N- terminalen Flag-Tags ist nicht mehr gelungen. Der Grund dafür konnte nicht gefunden werden. Die hohe Autofluoreszenz der Zellen machte durchflusszytometrische Untersuchungen insgesamt schwierig. Der Transfer von überexprimiertem TF auf Thrombozyten konnte funktionell nachgewiesen werden. Allerdings sind die oben genannten Methoden zur Aufklärung des Mechanismus unbedingt notwendig.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Expression und Funktion von P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1) in humanen glatten Gefäßmuskelzellen. Dissertation, 2010
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