Raman-spektroskopische Differenzierung und Identifizierung körpereigener Zellen und Mikroorganismen im Liquor für die medizinische Diagnostik.
Public Health, Healthcare Research, Social and Occupational Medicine
Final Report Abstract
Im Rahmen des Projektes „Raman-spektroskopische Differenzierung und Identifizierung körpereigener Zellen und Mikroorganismen im Liquor für die medizinische Diagnostik“ wurden an den Lehrstühlen von Prof. Dr. J. Popp (FSU Jena) und Prof. Dr. T. Deufel (Universitätsklinikum Jena) Untersuchungen zur Optimierung und zum Verständnis der Ramanspektroskopischen Identifizierung von Mikroorganismen aus realen Proben am Beispiel von Liquor cerebrospinalis durchgeführt. In vorangegangen Arbeiten konnte prinzipiell gezeigt werden, dass die Mikro-Raman-Spektroskopie geeignet ist, einzelne Bakterien zerstörungsfrei zu analysieren. Es hat sich aber auch gezeigt, dass bei der Aufstellung eines Ramanspektroskopischen Datensatzes von Einzelbakterien verschiedene Umgebungsparameter des zu untersuchenden Ökosystems beachtet werden müssen. Exemplarisch konnte im Laufe des Projekts gezeigt werden, dass (1) mittels Sayk-Kammer bzw. Zytozentrifugation Liquorproben für eine reproduzierbare Raman-spektroskopische Analyse präpariert werden können. (2) Durch die Verwendung der Fluoreszenz-Färbung können Bakterien innerhalb heterogener Proben lokalisiert werden, ohne die anschließende Ramanspektroskopische Analyse zu stören. Zusätzlich können durch die Kombination von bestimmten Farbstoffen bzw. von Farbstoffen die eine enzymatische Aktivierung benötigen lebende von toten Bakterienzellen unterschieden werden. (3) Die physiologischen Variationen von Bakterien während einer Kultivierung über mehrere Tage haben einen wesentlichen Einfluss auf die Raman-Spektren. (4) Für gut definierte Problemstellungen ist es dennoch möglich, die Bakterien aus der Liquorprobe eines Patienten Raman-spektroskopisch zu identifizieren. (5) Bei der Untersuchung von Resistenz-Mechanismen hat sich gezeigt, dass Kulturen mit aktiver Resistenz eindeutig von anderen Kulturen zu unterscheiden sind. (6) Für ein besseres Verständnis der Identifizierung wurden sowohl UV-Resonanz-Raman-Spektren wie auch Mikro- Raman-Spektren mit einer Anregungswellenlänge von 532 nm durch Vergleichsspektren von möglichen biochemischen Inhaltsstoffen angefittet. Die Ergebnisse zeigen zum einen die Unterschiede der Methoden und zum anderen inwieweit die Variationen innerhalb eines Ökosystems relevant für einen Raman-spektroskopischen Datensatz sind. Die Spezies- Identifizierung beruht dabei im Wesentlichen auf Protein- bzw. Zellwandkomponenten. Die besondere Bedeutung der bereits in den Raman-Experimenten gezeigten Protein-Komponenten konnten auch eindrucksvoll mittels SELDI-TOF-Spektrometrie zur Differenzierung von unterschiedlichen Spezies und Subspezies gezeigt werden. (7) Mit Hilfe der TERS- Spektroskopie ist es gelungen mit nm-Auflösung selektiv die Oberfläche eines Bakteriums zu messen, was einen weiteren wertvollen Einblick in die Biochemie der Mikroorganismen erlaubt. Die Ergebnisse dieses Projekts zeigen, dass die Mikro-Raman-Spektroskopie eine geeignete Methode zur kulturunabhängigen Identifizierung von Mikroorganismen darstellt. Die hier gewonnenen Erkenntnisse ermöglichen damit die zukünftige Erhebung von Ramanspektroskopischen Datensätzen zur Identifizierung von Bakterien aus komplexen medizinischen Proben wie beispielsweise Blut oder BAL (Bronchoalveoläre Lavage).
