Entwicklung einer Plattformtechnologie für Ganzzell-Biotransformationen in stabilen Emulsionen und deren Aufarbeitung mit komprimierten Kohlendioxid
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Innerhalb des abgeschlossenen Projektes wurde eine neue Plattformtechnologie für Ganzzell-Biotransformationen in stabilen Emulsionen und deren Aufarbeitung mit komprimiertem Kohlendioxid entwickelt. Als Modellreaktion wurde die stereospezifische Epoxidation von Styrol zu (S)-Styroloxid mit rekombinanten "Escherichia coli" betrachtet. Zweiphasige biokatalytische Funktionalisierungen mit ganzen Zellen haben großes Potential, klassische chemische Synthesen zur Produktion von Feinchemikalien zu ersetzen. Für die industrielle Implementierung dieser Prozesse stellt dabei die Aufarbeitung stabiler Emulsionen ein Hauptproblem dar. Die Aufklärung der Grenzflächeneffekte, die diese Emulsionsbildung verursachen, sowie die Entwicklung eines neuartigen Aufarbeitungsverfahrens der Fermentationsbrühe mit überkritischem CO2 waren dabei die Hauptziele dieses Projektes. Bereits in der ersten Projektphase konnten, anhand eines Schemas für die Fraktionierung der Inhaltsstoffe, die Stabilisierungsbeiträge einzelner Fraktionen aufgeklärt werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass die in der Reaktionslösung vorliegenden Zellen zu etwa 93 % für die Langzeitstabilität der Emulsionen verantwortlich sind und es sich somit bei der vorliegenden Emulsion um einen partikelstabilisierte Pickering-Emulsion handelt. Die Untersuchung von emulsionsstabilisierenden und -destabilisierenden Faktoren über einen interdisziplinären Ansatz hat gezeigt, dass die Bildung der Emulsion sowie deren finale Stabilität am Ende der Biotransformation von den Reaktionsbedingungen abhängt. So bildet sich die stabile Emulsion sofort nach Zugabe der organischen Phase und weist zu diesem Punkt die höchste Stabilität auf. Im Verlauf der Biotransformation nimmt dann die Emulsionsstabilität ab, was auf die steigende Produktkonzentration und die dadurch verursachte Toxifizierung der Zellen zurückgeführt werden konnte. Hinsichtlich der Emulsionsstabilisierung wurde gefunden, dass im Medium gelöste Proteine eine wichtige Rolle spielen. Nach Zugabe der organischen Phase nimmt die Proteinkonzentration in der wässrigen Phase sofort ab und genauso schnell bildet sich eine hydrophobe Zellfraktion aus, die nur nach katastrophaler Phaseninversion (plötzlicher Wechsel von einer Öl-in-Wasser Emulsion zu einer Wasser-in-Öl Emulsion) sedimentiert werden kann. Dieses kombinierte Auftreten von Emulsionsstabilisierung, Abnahme der Proteinkonzentration und Bildung einer hydrophoben Zellfraktion weist auf eine Interaktion von Proteinen mit den Zellen und der Phasengrenzfläche hin, die dann zur starken Stabilisierung der Emulsion beiträgt. Dieses Phänomen fand nur im operativen Bioreaktor mit Begasung statt. Es konnte gezeigt werden, dass der Energieeintrag (Rührergeschwindigkeit) zwar die absolute Emulsionsstabilität nicht aber das beschriebene Phänomen beeinflusst. Für die erwähnte katastrophale Phaseninversion wurde gefunden, dass diese ein wässrig-organisches Phasenverhältnis kleiner als ca. 1:3 bedingt. Es konnte gezeigt werden, dass die Biotransformation auch bei einem solchen Phasenverhältnis effizient abläuft (tiefere Produktkonzentration in der organischen Phase, höhere Produktkonzentration im Gesamtvolumen). Somit stellt diese Verfahrensweise eine vielversprechende Option dar, bei der die Bildung einer stabilen Emulsion umgangen wird. Hinsichtlich der Aufarbeitung mit scCO2 konnte innerhalb des Projektes ein Prozessfenster für die Phasentrennung und Produktextraktion definiert werden. Hierbei wird die Emulsion für wenige Minuten mit scCO2 behandelt, bei einer Temperatur oberhalb der kritischen Temperatur von CO2 sowie einem Druck, bei der die verwendete organische Phase vollständig im CO2 löslich ist. Innerhalb des Projektes wurde die Phasentrennung mit scCO2 an drei verschiedenen Biotransformationen getestet und die Anwendbarkeit als Plattformtechnologie nachgewiesen. Durch systematische Aufklärung des Mechanismus der Phasentrennung mit scCO2 wurde gezeigt, dass zwei wesentliche Teilschritte ablaufen: 1) Eine katastrophale Phaseninversion (plötzlicher Wechsel von einer Öl-in-Wasser Emulsion zu einer Wasser-in-Öl Emulsion), 2) eine Präzipitation von oberflächenaktiven Substanzen (u.a. Proteinen) hervorgerufen durch das eingelöste CO2. Um die ökonomischen Vorteile der entwickelten Plattformtechnologie nachzuweisen, wurden Simulationen mit Aspen Plus durchgeführt. Hierbei wurden ausgehend von den bei der Biotransformation erzielten Emulsionszusammensetzungen verschiedene Aufarbeitungssequenzen für die Produktion von 1000 t/a (S)-Styroloxid in einer Reinheit von 99 % simuliert und hinsichtlich der Kosten für die Aufarbeitung verglichen. Hierzu wurden zunächst die Phasengleichgewichte der beteiligten Komponenten in Systemen mit CO2 vermessen und die Parameter für die PC-SAFT Zustandsgleichung angepasst. Anschließend wurden anhand des Prinzips des "Conceptual Designs" 4 DSP-Alternativen generiert, die hinsichtlich der Produktausbeute und Selektivität von Styroloxid am Vielversprechendsten waren. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Aufarbeitungsverfahren basierend auf einer Phasentrennung mit scCO2, einer überkritischen Extraktion und einer anschließenden 2-stufigen Rektifikation das effizienteste Downstream Processing für den betrachteten Beispielprozess darstellt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2010), "Efficient phase separation and product recovery in organic-aqueous bioprocessing using supercritical carbon dioxide", Biotechnology and Bioengineering vol. 107, pp. 642-651
C. Brandenbusch, B. Bühler, P. Hoffmann, G. Sadowski, and A. Schmid
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(2010), "Supercritical phase behavior for biotransformation processing", Journal of Supercritical Fluids, vol. 55, pp. 635-642
C. Brandenbusch and G. Sadowski
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(2011), "Biokatalytische Epoxidierung von Styrol zu enantiomerenreinem (S)-Styroloxid", in Horst Chmiel Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg, Germany: pp. 486-488, ISBN: 978-3-8274-2476-1
C. Brandenbusch, B. Buehler, G. Sadowski, and A. Schmid
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(2012), "Downstream processing in biphasic biocatalysis by means of scCO2", Dissertation, Lehrstuhl für Thermodynamik, Technische Universität Dortmund, Dortmund, ISBN:978-3-843-90314-1
C. Brandenbusch
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(2012), "Integrated organic-aqueous biocatalysis and product recovery for quinaldine hydroxylation catalyzed by living recombinant Pseudomonas putida", Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, vol. 39, pp. 1049-1059
F. O. Ütkür, T. T. Tran, J. Collins, C. Brandenbusch, G. Sadowski, A. Schmid, and B. Bühler
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(2012), "Regioselective Aromatic Hydroxylation of Quinaldine Using Living Pseudomonas putida Cells Containing Quinaldine 4-oxidase", in John Whitthal and Peter Sutton Practical Methods in Biocatalysis and Biotransformations 2, Wiley ,Chichester, UK: pp. 153-157, ISBN: 978-1-119-99139-7
F. O. Ütkür, J. Collins, C. Brandenbusch, G. Sadowski, A. Schmid, and B. Bühler
