Regulation des Phosphoinositmetabolismus und der Clathrin-abhängigen Endozytose an chemischen Synapsen
Final Report Abstract
Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphospat (PIP2) steuert u.a. Membrantransportvorgänge wie die Clathrin-vermittelte Endozytose und das exo-endozytotische Recycling synaptischer Vesikel. Dabei unterliegt der Phosphoinositmetabolismus der regulatorischen Kontrolle PIP2-metabolisierender Enzyme. Zelluläres PI(4,5)P2 wird hauptsächlich durch Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-Kinasen Typ I (PIPKI) synthetisiert, im Zentralnervensystem maßgeblich durch die Isoform PIPKIγ-p90. Ausgehend von unserer Beobachtung, dass der Adapterkomplexes AP-2 direkt mit PIPKIγ-p90 assoziiert, haben wir die Interaktion nun im Detail biochemisch und molekular charakterisiert, sowie ihre Bedeutung für die katalytische Aktivität der Kinase bestimmt. Unsere Studien belegen, dass AP-2 mehrere Bindestellen für PIPKIγ-p90 aufweist, die von jeweils moderater Affinität im µM Bereich geprägt sind. Die Assoziation der µ-Untereinheit mit der katalytischen Domäne vermittelt eine drastische Steigerung der katalytischen Aktivität. Diese Steigerung ist abhängig von der gleichzeitigen Anwesenheit endozytotischer Sortiersignale (tyrosinbasierte Bindemotive) und erlaubt so lokal die Generierung eines PIP2-Pools, der die Assemblierung der AP-2/Clathrin-Hülle unterstützt. Daneben findet sich innerhalb der carboxyterminalen Domäne von PIPKIγ-p90 ein tyrosinbasiertes Motiv, dessen Bindung an AP-2µ die Kinaseaktivität ebenfalls stimulieren kann. Dieser Mechanismus der Autoaktivierung ist wahrscheinlich während solchen Ereignissen von Bedeutung, in denen nicht-tyrosinbasierte Sortiersignale die Endozytose vermitteln, wie dies etwa während der AP-2/Clathrin-abhängigen Internalisierung von synaptischen Vesikelproteinen der Fall ist. Eine dritte Bindestelle befindet sich in einem PIPKIγ-p90-spezifischen Spliceinsert, das zur Assoziation mit dem AP-2β-Ohr benötigt wird. Diese Interaktion spielt vermutlich nur bei der initialen Assoziation von AP-2 mit Frachtmolekülen eine Rolle, da sie durch Rekrutierung von Clathrin an AP-2β aufgelöst wird. Proteinkristallographische Analysen erlaubten uns darüber hinaus, spezifische Punktmutanten der carboxyterminalen Domäne zu generieren, die keinerlei Affinität mehr für AP-2 besitzen. In einem dominant-negativen Ansatz konnten wir zeigen, dass die Überexpression der Domäne in hippokampalen Neuronen zu einer signifikanten Akkumulation eines synaptischen Vesikelproteins and der Zelloberfläche führt. Dieser Effekt war nach Transfektion einer AP-2-bindedefizienten Variante abgeschwächt. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass der AP-2/PIPKIγ-Komplex von physiologischer Bedeutung für die Clathrin-abhängige Endozytose synaptischer Vesikel in Neuronen ist. Darüber hinaus ist es uns gelungen grundlegende molekulare Mechanismen der Regulation des Phosphoinositmetabolismus aufzuklären, welche Ansatzpunkte für zukunftige Interferenzstrategien von medizinischer Relevanz darstellen.
Publications
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