Mechanism of insertion of prosthetic groups into complex molybdo-enzymes (molybdo-iron-flavo enzymes)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Eukaryotische Molybdoenzyme der Xanthinoxidase-Familie wie Aldehydoxidase (AO) und Xanthindehydrogenase (XDH) benötigen als essentielle prosthetische Gruppen Flavinadenindinukleotid (FAD), zwei Eisen-Schefel-Cluster (Fe-S) vom 2Fe-2S-Typ sowie einen Molybdäncofaktor (Moco) in seiner sulfurierten Form. Im Rahmen des Teilprojektes 2 konnte gezeigt werden, dass die beiden Fe-S Cluster zuerst gebunden werden müssen, damit das Protein stabilisiert und vor Degradation geschützt wird. FAD wird entweder danach oder zeitgleich mit den Fe-S Clustern integriert, Moco auf jeden Fall zuletzt. Die Frage, ob direkt ein sulfurierter oder zunächst ein unsulfurierter Moco inseriert wird, konnte in in vitro- Experimenten beantwortet werden, da ausschließlich und offenbar spezifisch ein sulfurierter Moco in eine Moco-freie (demolybdo) XDH eingebaut wurde. In vivo wird dieser Schritt durch eine sogenannte Moco-Sulfurase katalysiert, wobei für das vorliegende Projekt das ABA3-Protein aus Arabidopsis thaliana als Modell diente. Typisch für Moco-Sulfurasen besteht ABA3 aus zwei distinkten Domänen: einer N-terminalen NifS-ähnlichen Domäne mit Pyridoxalphosphat(PLP)-abhängiger Cysteindesulfurase-Aktivität, an der ein Persulfidschwefel aus freiem L-Cystein gebildet wird, und einer C-terminalen Moco-Bindedomäne, auf die der Persulfidschwefel übertragen und dadurch der Moco in seine sulfurierte Form überführt wird. Beide Domänen von ABA3 besitzen jeweils 9 Cysteinreste, von denen einige strikt unter Moco-Sulfurasen konserviert sind und, außer in der Cysteindesulfurase-Aktivität, möglicherweise wichtige Funktionen bei der Bindung von Moco, dem Transfer des Persulfidschwefels von der NifS- auf die Moco-Bindedomäne, bei der Transformation von desulfo-Moco in sulfo-Moco, oder bei der Übertragung des sulfurierten Moco auf demolybdo-AO und -XDH haben. In der Tat wurde gefunden, dass von Cys430 der dort generierte Persulfidschwefel auf Cys758 übertragen wird, wobei dem benachbarten Cys755 eine besondere Rolle als redoxaktives Cystein zukommt, welches vermutlich über seinen Redoxzustand eine Interaktion mit den Zielenzymen AO und XDH zulässt oder eben nicht. Die Übertragung des Moco wird letztlich, wie in EXAFS- und XANES-Experimenten gezeigt, durch induzierte reduktive Spaltung einer Protein/Cys-S-S-Mo(+IV)-Bindung in einen Protein/Cys-SH + S-Mo(+VI)-Zustand erzielt. Als Induktor für diese Reaktion wird höchstwahrscheinlich ein demolybdo-Zielprotein zusammen mit Reduktionsäquivalenten benötigt, da die Reaktion nur in Gegenwart von NADPH abläuft, wie in Aktivierungsexperimenten mit Moco-beladenem ABA3 und demolybdo-XDH gezeigt werden konnte. Eine Aufklärung der Struktur von ABA3 mit 3D-Röntgenstrukturanalyse gelang zwar im Rahmen dieser Arbeit nicht, jedoch konnten zum einen durch SAXS-Analyse die Raummodelle von ABA3 sowie seinen separat exprimierten Domänen erhalten werden, zum anderen konnten Strukturmodelle für die C-terminale Moco-Bindedomäne erstellt werden, wobei der C-Terminus in die zwei “Moco Sulfurase C-terminal-containing (MOSC)”-Subdomänen MOSC-N und MOSC zu unterscheiden ist. Innerhalb der MOSC-Subdomäne befindet sich der Hauptteil des unter Moco-Sulfurasen konservierten Moco-Bindemotivs, das durch ebenfalls konservierte Reste der MOSC-N-Domäne komplettiert wird. Bemerkenswerter Weise sind beide Subdomänen durch einen kurzen Linker miteinander verbunden, der eine gewisse, für die Bindung und das Entlassen von Moco erforderliche Flexibilität ermöglicht. Auch hierbei spielen neben dem Cys758 mit dem Cys755 in der MOSC-Domäne und Cys542 in der MOSC-N-Domäne weitere konservierte Cysteinreste beider Subdomänen eine entscheidende Rolle.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Mo cofactor biosynthesis and crosstalk with FeS. In Metals in Cells, edited by V. Culotta and R.A. Scott. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd., 529-541
Bittner, F. and Mendel, R.R.
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(2014) Molybdenum metabolism in plants and crosstalk to iron. Front Plant Sci. 5: 28
Bittner F
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(2014) Molybdenum site structure of MOSC family proteins. Inorg. Chem. 53, 9460-9462
Giles LJ, Ruppelt C, Yang J, Mendel RR, Bittner F, Kirk ML
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(2015) Oxyl and hydroxyl radical transfer in mitochondrial amidoxime reducing component-catalyzed nitrite reduction. J. Am. Chem. Soc. 137, 5276-5279
Yang J, Giles LJ, Ruppelt C, Mendel RR, Bittner F, Kirk ML
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(2015) Sulphur shuttling across a chaperone during molybdenum cofactor maturation. Nat. Commun. 6, 6148
Arnoux P, Ruppelt C, Oudouhou F, Lavergne J, Siponen MI, Toci R, Mendel RR, Bittner F, Pignol D, Magalon A, Walburger A
