Die Rolle intestinaler microRNAs und ihrer Zielgene in der postnatalen Darmentwicklung von Ferkeln insbesondere während der Absetzphase und nach Pathogen- sowie Probiotika-Pathogen-Exposition
Final Report Abstract
Infektionen von Ferkeln während der Absetzphase können mit erhöhter Mortalität einhergehen. In dieser Phase werden Ferkel neuen mikrobiellen sowie Nahrungs-Antigenen ausgesetzt. Während dieses Zeitraumes finden essentielle morphologische und funktionelle Veränderungen der Darmmukosa statt, die über eine Regulierung der Genexpression gesteuert werden. MiRNAs werden hierbei als bedeutende Regulatoren der Genexpression angesehen. Ihre Beteiligung an Zelldifferenzierungsvorgängen oder der Organenhwicklung aber auch bei Wirt-Pathogen-Interaktionen wurde bereits beschrieben. Das Ziel des hier geförderten Projekts bestand darin, eine integrierte Expressionsanalyse von mRNA sowie miRNA durchzuführen, die zum besseren Verständnis der regulatorischen Netzwerke im Rahmen der postnatalen Darmentwicklung bei Ferkeln beiträgt. Die Microarray-Analysen zeigten, dass wichtige miRNAs zum Zeitpunkt des Absetzens differentiell reguliert gewesen waren; diese waren vor allem an Signalkaskaden beteiligt, die Einfluss bei Wirt-Pathogen-Interaktionen sowie Zellproliferations-Vorgängen haben. Des Weiteren wurden erstmalig Regulatoren vorhergesagt, die während der postnatalen Darmentwicklung eine entscheidende Rolle, insbesondere bei der Ausbildung von Entzündungsgeschehen spielen könnten. Die Phase des Absetzens wird mit einer verstärkten Infektanfälligkeit der Ferkel gegenüber Pathogenen in Verbindung gebracht, insbesondere gegen Salmonellen. Aus diesem Grund bestand ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit in der Charakterisierung des regulatorischen Einflusses von miRNAs während einer experimentellen S. Typhimurium Infektion bzw. gleichzeitiger Applikation eines Probiotikums (E. faecium). Die Untersuchung der Darmabschnitte Ileum und Colon ascendens zeigte erstmalig die darmabschnittsspezifische und zeitlich unterschiedliche Beeinflussung von Salmonellamodulierten Signalkaskaden durch miRNAs. Beide Darmabschnitte wurden aus diesem Grund getrennt voneinander betrachtet. Im Colon ascendens wurden v.a. miRNAs identifiziert, die Einfluss auf die Immunantwort nahmen. Unsere Analysen zeigten eine verstärkte miR-34a Expression nach Salmonella-lnfektion, das potentielle Zielgen dieser miRNA, der Selektin-P-Ligand (SELPLG) zeigte erwartungsgemäß eine verminderte Expression. Die integrative Analyse der mRNA und miRNA Expressionsprofile im Ileum ergab vor allem einen regulatorischen Einfluss der miRNAs wahrend der Salmonellen-Infektion auf fokale Adhäsion und Regulierung des Aktin-Zytoskeletts. Die miR-29a übernahm dabei eine herausragende regulatorische Funktion, beispielsweise auf die Caveolin 2-Expression (CAV2). Die Hochregulierung der miR-29a nach Salmonella-lnfektion ging mit verminderter CAV2- Expression einher. Weitergehende funktionelle Analysen bestätigten CAV2 als direktes Zielgen der miR-29a. Ein knock-down von CAV2 resultierte in einer Proliferationshemmung von porcinen sowie humanen intestinalen Zellen. Des Weiteren konnte eine erhöhte Salmonelleninvasion in humane intestinale Zellen durch Regulierung des Aktivierungsstatus der RhoGTPase CDC42 nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit liefert die ersten neuen Ansatzpunkte für eine alternative Salmonellenbekämpfung und erschließt neue Möglichkeiten, den Einsatz von Antibiotika z.B. in der Tierzucht zukünftig weiterhin drastisch zu reduzieren. Auch können die hier beschriebenen regulatorischen Vorgänge eine Basis für die Entwicklung RNAi-basierter Therapie-Möglichkeiten von Darminfektionen beim Menschen bilden.
Publications
- (2010). Deciphering the porcine intestinal microRNA transcriptome. BMC Genomics 11, 275
Sharbati, S., Friedlander, M. R., Sharbati, J., Hoeke, L., Chen, W., Keller, A., Stahler, P. F., Rajewsky, N. & Einspanier, R.
- (2012). Quantification and accurate normalisation of small RNAs through new custom RT-qPCR arrays demonstrates Salmonella-induced microRNAs in human monocytes. BMC Genomics 13, 23
Sharbati, S., Sharbati, J., Hoeke, L., Böhmer, M. & Einspanier, R.
(See online at https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-23) - microRNAs: Klein, nicht codierend aber regulierend. Habilitationsschrift, Fach Biochemie an der veterinärmedizinischen Fakultät der FU Berlin
Soroush Sharbati
