Identifizierung und funktionelle Untersuchung von humanen adulten spermatogonalen und germalen Stammzellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass folgende Arbeitsziele innerhalb des Projektes erreicht worden sind: Ein Hauptziel unserer Arbeiten war es, stärker angereicherte adulte humane spermatogonale Zellkulturen bzw. stärker angereicherte humane adulte Keimstammzellkulturen zu generieren. Hierzu sollten verschiedene Anreicherungsverfahren, u.a. Transfektion mit lentiviralen Reporterkonstrukten, FACS, MACS und Matrixselektion verwendet werden. Die Arbeiten zum FACS wurden von der Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Bühring durchgeführt. In unseren eigenen Arbeiten kamen wir zu dem Ergebnis, dass es uns gelungen ist hSSC Langzeitkulturen anzulegen, was laut Literatur bisher nicht möglich war. Die Anreicherung der Spermatogonien direkt aus dem Patientenmaterial, gestaltet sich weiterhin als schwierig, da keine verfügbaren Marker vorhanden sind, die zu einer 100%ig reinen Aufreinigung führen. Deshalb ist eine weitere manuelle Selektion mit Hilfe eines Mikromanipulators notwendig. Dieses Protokoll ist standardisiert worden und führt bei Hodengewebe mit wenig Pathologie und damit mit ausreichend vorhandenen Spermatogonien zur Etablierung einer hSSC Kultur, einschließlich von Langzeitkulturen. Hier zeigte sich, dass die Zellen über die längere Kultivierungszeit ihre Keimzelleigenschaften im Expressionsprofil verändern. Diese Zellkulturen wurden umfangreich über Fluidigm-Real-PCR, Mikroarray immunhistochemische Verfahren charakterisiert. Die Anreicherung der haGSC Kulturen wurde klonal (50-500 Zellen) von uns durchgeführt und es wurden verschiedene lentivirale Konstrukte ausgetestet. Leider kam es hier nicht zu dem gewünschten Erfolg. Zusammenfassend lässt sich nur sagen, dass die haGSC Kulturen unbedingt klonal angelegt werden sollten, da sich die Klone untereinander in ihrer Expression von Pluripotenzmarkern, in ihrer Proliferation und damit auch in ihrer Differenzierungsfähigkeit stark unterscheiden. Somit kann dadurch auf bessere Klone zurückgegriffen werden, mit denen weitergearbeitet werden kann. Die haGSC Kluster lassen unter anderem mit einer alkalischer Phosphatase Reaktion im Live Staining (LifeTechnologies) markieren und selektieren. Um die Qualität der entstehenden haGSC-Linien zu analysieren, wurde die Expression von Keimzell- und Stammzellmarkern, wie sie typischerweise auf verschiedenen Keimzellen und pluripotenten Stammzellen zu finden sind untersucht und gegen das Expressionsmuster von hES-Zellen, unterschiedlichen humanen Fibroblasten und Seminomzellen verglichen. Verschiedene Verfahren zur Analyse des Transkriptoms über Fluidigm Real-time PCR und Mikroarray-Analysen von haGSC-Zelllinien wurden erfolgreich übertragen. Detaillierte Charakterisierung der generierten klonalen haGSC-Linien erfolgte bisher durch die Untersuchung ihres Transkriptoms (mRNA-Array), über einen Proteome Profiler Human Pluripotent Stem Cell Array Kit u.a. für OCT4A, NANOG, SOX2 und E-Cadherin. Für die Auswertungen der Microarray-Untersuchungen der SSC Kulturen und der klonalen haGSC-Zelllinien wurden in Kooperation mit einer hierauf spezialisierten Firma herangezogen. Die Fluidigm-Real-time PCR und Mikroarray Analysen zeigten, dass es sich bei den haGSC Klonen, weiterhin um heterogene Zellpopulationen handelt, die ein Keimzellprofil und ein unterschiedlich starkes Expressionsprofil mit zentralen Pluripotenzgenen besitzen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Generation of Germline-Derived Stem Cells from the Adult Human Testis. In: Regenerative Medicine, Gustav Steinhoff (ed.), Spinger Science+Business Media New York 2011, pp. 207-224
Skutella T, Conrad S
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Potential stemness of frozen-thawed testicular biopsies without sperm in infertile men included into the in vitro fertilization programme. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:291038
Stimpfel M, Skutella T, Kubista M, Malicev E, Conrad S, Virant-Klun I
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Spermatogonial Stem Cells. In: Advances in Stem Cell Research, H. Baharvand and N. Aghdami (ed.), Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Spinger Science+Business Media New York 2012, pp.191-210
Azizi H, Conrad S, Skutella T, Virant-Klun I
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Differential gene expression profiling of enriched human spermatogonia after short- and long-term culture. Biomed Res Int. 2014;2014:138350
Conrad S, Azizi H, Hatami M, Kubista M, Bonin M, Hennenlotter J, Renninger M, Skutella T
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Expression of Genes Related to Germ Cell Lineage and Pluripotency in Single Cells and Colonies of Human Adult Germ Stem Cells. Stem Cells International, Volume 2016, Article ID 8582526, 17 pages
Sabine Conrad, Maryam Hatami, Hossein Azizi, Mikael Kubista, Michael Bonin, Jörg Hennenlotter, Karl-Dietrich Sievert and Thomas Skutella
