Dynamics of subunit interactions in ECF transporters

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Eitinger
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2009 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 137770702

Energy-coupling factor (ECF)"-Transporter enthalten ein substratspezifisches (S) und ein moderat konserviertes (T) integrales Membranprotein sowie ABC-ATPasen (A). Im Gegensatz zu kanonischen ABC-Importern besitzen sie keine extryzytoplasmatischen Substratbindeproteine. Die oligomere Zusammensetzung aus A-, T- und S-Komponenten, die exakten Rollen der S- und T- Einheiten sowie die molekularen Mechanismen, die die Hydrolyse von ATP mit Bewegungen in den Transporterkomplexen zur Substrattranslokalisation koppeln, sind umstritten bzw. unbekannt. Während die Kristallstrukturen dreier S-Einheiten monomere Formen mit gebundenem Substrat zeigen, deuten in vivo-Analysen, Mutagenesestudien und Quervernetzungsexperimente auf oligomere Zustände der S- und möglicherweise auch der T-Einheiten als funktionelle Zustände hin. Schwerpunkt des Vorhabens werden Biotin-Transporter (BioYMN) sein. Unsere bisherigen Ergebnisse favorisieren einen dimeren Zustand von BioY als der funktionellen S-Einheit, die auch als alleinige Komponente nicht nur Substratbinde-, sondern zusätzlich Transportfunktion besitzt. Diese kontrovers diskutierte Interpretation der vorliegenden Daten soll mit Hilfe eines geeigneten Reporterstamms von E. coli und mehreren BioY-Homologen als Objekten im in vivo-System eindeutig geklärt werden. Die oligomeren Zustände der T-Einheit BioN und von BioY werden mit fluoreszenzspektroskopischen und –mikroskopischen Verfahren in lebenden Zellen und nach Rekonstitution gereinigter Transporterkomplexe in Nano-Discs analysiert. Komplementär wird dieser Aspekt mit EPR-Analysen spinmarkierter Komplexe in Nano-Discs verfolgt. Die Dynamik der Untereinheiten während des ATP-Hydrolysezyklus wird durch kinetische Analysen, "Pull-down"- und EPR-Experimente untersucht. Eine strukturbiologische Zusammenarbeit verfolgt das Ziel, die Raumstruktur eines ECF-Holotransporters aufzuklären und damit direkte Hinweise auf die Anordnung der Untereinheiten im Komplex zu erhalten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen