Regulation der glomerulären Schlitzmembran durch Protein Kinase C
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Entstehung einer Proteinurie ist nicht nur ein Warnsymptom einer Störung des glomerulären Nierenfilters, sondern beeinflusst den Krankheitsverlauf ganz wesentlich. Der glomeruläre Filter ist dreischichtig aufgebaut. Die äußere Barriere wird durch die Podozyten mit der Schlitzmembran gebildet. Das Protein Nephrin bildet dabei das „Rückgrat“ der Schlitzmembran. Fehlt bei einer seltenen Erbkrankheit Nephrin komplett, so resultiert eine Schwere Proteinurie. Wesentlich häufiger sind aber die erworbenen Schädigungen, die zum Teil auch reversibel sind. Hier konnten wir im Vorfeld zeigen, dass die Koppelung des Adapterproteins β-Arrestin2 an Nephrin zu einer Entfernung von Nephrin aus der Schlitzmembran durch Endozytose führt. Im vorliegenden Projekt sollte nun der Mechanismus näher geklärt werden. Insbesondere sollte die Rolle der Protein Kinase C alpha (PKCα) näher beleuchtet werden. Wir konnten zeigen, dass verschiedene „Stressoren“, wie Hyperglykämie, Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFα) und Angiotensin II zu einer Aktivierung von PKCα im Podozyten führen. Die aktivierte PKCα bindet und phosphoryliert den intrazellulären Anteil von Nephrin. Die Phosphorylierung erfolgt an zwei spezifischen Aminosäuren (Threonin 1120 und 1125), wodurch ein klassisches Bindungsmotiv für β-Arrestin2 entsteht. Die Ergebnisse zeigen erstmalig, daß auch die Phosphorylierung von Serinen und Threoninen eine entscheidende Rolle in der Regulation der Schlitzmembran eine Rolle spielt. Die Bindung von β-Arrestin2 führt dann zur Kopplung von Nephrin an die Endozytosemaschinerie der Zelle und zur Entfernung von Nephrin von der Zelloberfläche. Dies bekräftigte unsere Theorie, dass der Verlust von Nephrin unter Stressbedingungen zu einer Störung des glomerulären Filters und so zu einer Proteinurie führt. Die oben beschriebenen Ergebnisse warfen die Frage auf, ob es neben PKCα weitere, eventuell übergeordnete Kinasen gibt, die eine Rolle für die Regulation der Schlitzmembran eine Rolle spielen. Durch Untersuchungen verschiedener Kinasen konnte die MAP-Kinase p38 als Kandidat isoliert werden. Interessanterweise wird p38 im Podozyten ebenfalls durch hohe Glucosespiegel aktiviert. Die Aktivierung ermöglicht die Bindung von p38 an Nephrin mit konsekutiver Phosphorylierung. Ob und wie p38 in sich in die PKCα-β-Arrestin2-Achse einfügt, ist Gegenstand weiterer Untersuchungen. Da sich der komplexe Aufbau des glomerulären Filters nicht in vitro nachbilden lässt, erfolgten die weiteren Untersuchungen der PKCα-β-Arrestin2-Achse im Mausmodell. Da die diabetische Nephropathie weiterhin die häufigste Ursache für eine dialysepflichtige Niereninsuffizienz ist und β-Arrestin2 das entscheidende Molekül für die Endozytose von Nephrin ist, untersuchten wir zunächst die Proteinurie in diabetischen β-Arrestin2-defizienten Mäusen im Vergleich zu ihren Wildtypgeschwistern. Hier zeigte sich, dass die Mäuse ohne β-Arrestin2 deutlich weniger Proteinurie entwickeln als die Wildtypen. Hierfür entwickelten wir einen neuen Assay, der es erstmalig erlaubt, den Grad der Endozytose in der Maus zu messen. Wir konnten zeigen, dass die β-Arrestin2-defizienten Tiere nicht nur weniger Proteinurie entwickelten, sondern auch mehr Nephrin in der Schlitzmembran aufwiesen. Diese Ergebnisse stützen unsere These, dass die Entfernung von Nephrin aus der Schlitzmembran zur Dysfunktion des glomerulären Filters führt. Zusammenfassend konnten wir einen neuen Pathomechanismus zur Entstehung einer Proteinurie beschreiben. Die Mediatoren PKCα, p38 und TNF sind jetzt schon pharmakologisch beeinflussbar. Aktuell sind die Inhibitoren noch zu unspezifisch und daher mit zu vielen Nebenwirkungen verknüpft. Das klinische Interesse an gezielteren nephrologischen Therapien ist sehr groß, do dass zukünftig mit neuen Inhibitoren zu rechnen ist, die eine spezifischere Behandlung der von uns identifizierten Zielproteine erlauben.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. J Biol Chem. 2011 Apr 15;286(15):12959-70 [2012 Jühling-Preis der Anna-Wunderlich-Ernst-Jühling-Stiftung]
Quack I, Woznowski M, Potthoff SA, Palmer R, Königshausen E, Sivritas S, Schiffer M, Stegbauer J, Vonend O, Rump LC, Sellin L
