Etablierung von 2-Photonen Mikroskopie zur Detektion von paGFP in planta zur Untersuchung des gerichteten Transports von Transkriptionsfaktoren aus und in den Nucleus
Final Report Abstract
Die photo-aktivierbare Mutante des Green-Fluorescent Proteins (paGFP) eignet sich gut zur Aufklärung dynamischer Vorgänge in lebenden Systemen, da durch die Photoaktivierung ein exakter Startzeitpunkt für eine gegebene Population von solcherart markierten Proteinen definiert wird. Die Verwendung eines parallelisierten 64 Foci 2-Photonen Laser Scanning Mikroskops erlaubt nicht nur eine dreidimensionale Auflösung schneller dynamischer Prozesse, sondern auch eine genaue örtliche Auflösung hinsichtlich der zu aktivierenden Population. Diese Kombination von hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung konnte erfolgreich zur Aufklärung der Dynamik des Transkriptionsfaktors LCL1 gekoppelt mit paGFP eingesetzt Tabak BY-2 Protoplasten eingesetzt werden. Es konnte der rasche Transport einer aktivierten Population von pa-GFP-LCL1 Proteinen beim Transport aus dem Nukleus, bis zum eintreten eines Gleichgewichts, verursacht durch den Reimport, beobachtet und die Zeitkonstante bestimmt werden. Die gemittelte Zeitkonstante beträgt 51 Sekunden für den gerichteten Tranport. Für die Export negative Mutante paGFP-LCU(NESm), die XPO1-Bindedomäne wurde durch mehrfachen Aminosäureaustausch zerstört, wurde kein Transport aus dem Nukleus beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde für die reine Diffusion einer im Nukleus aktivierten paGFP Population eine gemittelte Zeitkonstante von 125 Sekunden berechnet. Durch diese Kombination der photo-aktivierbaren Mutante des Green Fluorescent Proteins (paGFP) als Fluoreszenzmarker und von 2-Photonen Mikroskopie konnte die intrazelluläre Dynamik des Transports und die dreidimensionale Verteilung des MYB1R Transkriptionsfaktors LHY/CCA1 -like (LCL1) aufgeklärt werden. Zur Untersuchung in planta wurden transgene Arabidopsis thaliana (Col) Pflanzen hergestellt. Hierzu wurden Fusionsproteine von paGFP mit LCL1, LCL2, LCLI(NESm) und solitäres paGFP umkloniert und über ein Agrobacterium in die Pflanzen inseriert. Nach entsprechender Selektion stehen nunmehr vier transgene Linien in der T2-Generation zur Verfügung. Erste Untersuchungen an diesen wurden vorgenommen.
Publications
- Analysis of subcellular surface structure, function and dynamics. Anselmetti D, Hansmeier N, Kalinowski J, Martini J, Merkle T, Palmisano R, Ros R, Schmied K, Sischka A, Toensing K. Anal Bioanal Chem. 2007 Jan;387(1):83-9. PMID: 17082883
- Multifocal two-photon laser scanning microscopy combined with photoactivatable GFP for in vivo monitoring of intracellular protein dynamics in real time. Martini J, Schmied K, Palmisano R, Toensing K, Anselmetti D, Merkle T. J Struct Biol. 2007 Jun;158(3):401-9. PMID: 17363273
