Zeitauflösendes Rasterfluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das beschaffte Gerät wurde vornehmlich zur Erforschung und Entwicklung fortgeschrittener, mikroskopischer Fluoreszenzmesstechniken in mikrofluidischen Reaktor- und Analysesystemen eingesetzt. Hiermit wurde in verschiedenen Forschungsprojekten einer der größten Herausforderungen sogenannter lab-on-a-chip Systeme begegnet, dem sensitiven, markierungsfreien Nachweis geringster Substanzmengen. Einen Schwerpunkt bildeten hierbei miniaturisierte, chipbasierte Trenntechniken, wie die Chipelektrophorese (MCE). Durch Anwendung des beschafften leistungsfähigen Systems konnten nicht nur Sensitivitätsdaten zum fluoreszenten Nachweis kleiner aromatischer Moleküle in der MCE deutlich verbessert werden, es gelang auch erstmals die gleichzeitige Bestimmung der Fluoreszenzlebenszeit (FL) durch zeitkorreliertes Einzelphotonenzählen nach Anregung mit dem beschafften Picosekundenlaser bei 266 nm. Mit diesem Messaufbau gelang auch eine wesentlich sensitivere, markierungsfreie Erfassung von Proteinen und anderen bioaktiven Molekülen mit der Möglichkeit der verbesserten Analytzuordnung mit Hilfe der „on-the-fly“ bestimmten Fluoreszenzlebenszeiten. Dieses Prinzip wurde in einem Projekt mit dem Thema der integrierten on-chip Synthese angewendet. Hier wurde erstmals ein integrierter chipbasierter Ansatz zur Verknüpfung einer enantioselektiven Organokatalyse mit anschließender Auftrennung des Reaktionsgemisches und gleichzeitiger Bestimmung der Fluoreszenzlebenszeiten realisiert. Es zeigte sich, dass die Fluoreszenzlebenszeiten äußerst nützlich sind, um die Reaktionsedukte und Produkte im schnellen Durchfluss voneinander zu unterschieden. Die Auftrennung der Enantiomere gelang durch Zusatz von Cyclodextrinen, wobei sich interessanterweise die Fluoreszenzlebenszeiten der komplexierten Enantiomerenpaare unterschieden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde ein mikroskopischer Aufbau zur Zweiphotonenanregung (TPE) entwickelt, um UV-Fluorophore auch in Materialen zu erfassen, die im Spektralbereich des tiefen UV nicht transparent sind. Durch die hohe Strahlungsleistung des Picosekundenlasers bei 532 nm gelang trotz der für TPE relativ langen Pulsdauer von ca. 12 ps ein sehr sensitiver Detektionsaufbau unter gleichzeitiger Aufnahme der Fluoreszenzlebenzeiten. Durch Vergleich der Ergebnisse mit der entsprechenden Einphotonenanregung im tiefen UV konnte so ein umfassendes Bild der Möglichkeiten und Grenzen der markierungsfreien Zweiphotonenanregung in mikrofluidischen Chips gezeichnet werden. Einer der Hauptvorteile der TPE im Kontext der lab-on-a-chip Technologie ist die Möglichkeit des Einsatzes von ökonomischen und leicht verfügbaren Materialien, sowohl für die Chipfertigung als auch für die Detektionsoptiken. Während für die klassische Einphotonenanregung hochreines Quarzglas obligatorisch ist, ermöglicht die Zweiphotonenanregung auch die Anwendung von Glas- oder Polymermaterialien. Neben der klassischen Chipelektrophorese wurde das System auch zur Realisierung der ersten markierungsfreien Detektion in der mikrofluidischen Freiflusselektrophorese (µFFE) eingesetzt. Hierzu wurde der UV-Laser zur großflächigen Verfolgung nativ fluoreszenter Analytströme wie Proteine und biogene Amine in speziellen Quarzchips in einen Laserscanaufbau eingekoppelt. Durch Fluoreszenzrasteraufnahmen konnten wir mit dem beschafften System nachweisen, dass durch partielle Ätzschritte ein effizienter Zugang zur notwendigen Einkopplung elektrischer Felder in der Freiflusselektrophrese eröffnet wird. Ein Schwerpunkt des Konfokalmikroskops mit Anregung und Detektion im sichtbaren Spektralbereich war die Untersuchung mikrofluidischer Tröpfchenplattformen. Dabei wurden Mikrotröpfchen als distinkte Reaktionskompartimente genutzt, um Protein-Ligand Interaktionen im Hochdurchsatz zu verfolgen. Hier gelang die Aufnahme der Fluoreszenzlebenszeiten in einzelnen Mikrotröpfchen mit nanomolarer Sensitivität. Zudem wurde das Mikroskopsystem auch fakultätsübergreifend für ganz unterschiedliche Anwendungen eingesetzt, wie beispielsweise der bildhaften, fluoreszenten Untersuchung von Proben aus der Materialforschung. Ein aktueller Schwerpunkt der Forschung ist die Entwicklung von integrierten, chemischen Mikrolaboratorien, in denen der schnelle und hochsensitive Analytnachweis unter Einsatz des beschafften konfokalen Fluoreszenzlebenszeitmikroskop von zentraler Bedeutung ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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LabelFree Analysis in Chip Electrophoresis Applying Deep UV Fluorescence Lifetime Detection. Electrophoresis 2011, 32, 3108-3114
Reinhild Beyreiss, Stefan Ohla, Stefan Nagl, Detlev Belder
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Microfluidic chips for chirality exploration. Anal. Chem. 2011, 83, 3232– 3238
Reinhild Beyreiss, Stefan Ohla, Stefan Nagl, Detlev Belder
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Labelfree Detection in Microchip Free-Flow Electrophoresis using Deep UV Laser Scanning Fluorescence Detection. Lab Chip 2012, 12, 458-463
Stefan Köhler, Stefan Nagl, Stefanie Fritzsche, Detlev Belder
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Monitoring on-Chip Pictet-Spengler Reactions by Integrated Analytical Separation and Label-Free Time-Resolved Fluorescence. Chem. Eur. J. 2012, 18, 1240-1246
Stefan Ohla, Reinhild Beyreiss, Stefanie Fritzsche, Petra Gläser, Stefan Nagl, Kai Stockhausen, Christoph Schneider, Detlev Belder
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Crossing the Border towards Deep UV Time-Resolved Microscopy of Native Fluophores. Biophysical Journal, 2013, 104, 667A-667A
Marcelle Koenig, Sebastian Tannert, Thomas Schoenau, Kristian Lauritsen, Felix Koberling, Rainer Erdmann, Reinhild Beyreiss, Stefan Nagel, Detlev Belder
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Label-free fluorescence detection of aromatic compounds in chip electrophoresis applying two photon excitation and time-correlated single photon counting. Anal. Chem. 2013
Reinhild Beyreiss, David Geißler, Stefan Ohla, Stefan Nagl, Tjorben N. Posch, Detlev Belder
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Microfluidic free-flow electrophoresis chips with an integrated fluorescent sensor layer for real time pH imaging in isoelectric focusing. Chem. Comm. 2013, 49, 904-906
Stefan Jezierski, Detlev, Belder, Stefan Nagl
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Protein-protein interaction analysis in single microfluidic droplets using FRET and fluorescence lifetime detection. Lab Chip 2013, 13, 2808-2814
Christian Benz, Heiko Retzbach, Stefan Nagl, Detlev Belder
