LCMS/MS (Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometer)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Analyse von Proteinmodifikationen in erhitzten Milchprodukten: Milchprodukte werden in der Regel vor dem Inverkehrbringen thermisch behandelt, um die mikrobielle Stabilität während der Lagerung zu gewährleisten. Dies führt zu einer teils deutlichen Modifizierung von Aminosäureseitenketten in den Milchproteinen, was deren ernährungsphysiologische, toxikologische und technologische Eigenschaften verändert. Mit der finanzierten UHPLC-MS/MS wurde eine Methode etabliert, mit der die Hitzemarker Lactulosyllysin, Nε-Carboxymethyllysin, Methioninsulfoxid nach Totalhydrolyse in Milchprodukten quantifiziert werden konnten. Damit steht eine Methode zur Verfügung, die die Bewertung der Hitzeschädigung von Milchprodukten und die Einschätzung der Herabsetzung der biologischen Wertigkeit der Milchproteine erlaubt. Zur umfassenden Aufklärung weiterer entstandenen Strukturen wurde einerseits eine ungerichtete Methode mittels MALDI-TOF-MS mit offline-HPLC-Fraktionierung entwickelt, um die wichtigsten Modifikationen von αs1-Casein in Milch und Milchprodukten zu detektieren und relativ zu quantifizieren. Die zuverlässige Lokalisierung der detektierten Modifikationen erfolgte im Anschluss mittels UHPLC-MS/MS. Andererseits wurde in einem weiteren Ansatz gezielt nach Modifikationen in Molkenproteinen gesucht. Im Totalionen- bzw. Fragmentionen-Scan konnten so in α-Lactalbumin 13 Modifikationen, in β-Lactoglobulin 56 Modifikationen identifiziert und in der Aminosäuresequenz lokalisiert werden. Weiterhin wurde eine empfindliche Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode entwickelt, mit der in β-Lactoglobulin aus verschiedenen Milchprodukten erstmals 14 verschiedene Strukturen an 25 Bindungsstellen im Protein semiquantifiziert werden konnten. Die entwickelten ortspezifischen Methoden tragen damit dazu bei, die hitzeinduzierten Reaktionen in Milch besser zu verstehen und Veränderungen der ernährungsphysiologischen und technologischen Eigenschaften der Milchproteine vorherzusagen. Quantifizierung von Peptidkonservierungsstoffen in Lebensmitteln: Die aus 34 Aminosäuren bestehenden Oligopeptide Nisin A und Nisin Z wirken gegen grampositive Bakterien antibakteriell. Laut Zusatzstoffzulassungsverordnung dürfen sie gegen Verderbnis und Spätblähung in gereiftem Käse in Mengen bis zu 12 mg Nisin/kg eingesetzt werden. Mit dem finanzierten LC-MS/MS-Gerät wurde eine Methode entwickelt, die beiden Peptidkonservierungsstoffe und jeweils ihre zwei bekannten Abbauprodukte in gereiftem Käse nach Extraktion mit 0,02 M Salzsäure robust und empfindlich zu quantifizieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass während der Schmelzkäseherstellung Nisin A und Z zu 82,5 % bzw. 44,5 % abgebaut werden, wobei nicht die bekannten Reaktionswege für diesen Abbau verantwortlich waren. Die entwickelte Methode kann nun durch die amtliche Lebensmittelüberwachung als analytische Grundlage genutzt werden, um die rechtskonforme Verwendung der beiden Peptidkonservierungsstoffe zu kontrollieren. Identifizierung und Quantifizierung von Glucoseabbauprodukten in Peritonealdialyse-Lösungen und Lebensmitteln: Peritonealdialyse (PD)-Lösungen werden als patientenfreundliche Alternative zur Hämodialyse eingesetzt und enthalten als osmotisches Agens meist Glucose oder Oligosaccharide. Zur Sterilisierung werden PD-Lösungen hitzebehandelt, was einen partiellen Zuckerabbau zu reaktiven α-Dicarbonylen nach sich zieht. Da diese cytotoxische und proinflammatorische Eigenschaften aufweisen, sind eine genaue Kenntnis der entstehenden Strukturen sowie deren Minimierung angezeigt. Auf dem finanzierten Gerät wurde eine UH-PLC-DAD-MS/MS-Methode entwickelt, mit der sechs α-Dicarbonyle in PD-Lösungen nach Derivatisierung mittels MS/MS zuverlässig identifiziert und mittels DAD empfindlich quantifiziert wurden. Darüber hinaus wurde ihre Reaktivität gegenüber Körperproteinen untersucht, indem mit Hilfe eines Modellpeptids die Reaktionen zwischen reaktiven Aminosäureseitenketten und den α-Dicarbonylen charakterisiert und die wichtigsten entstehenden Verbindungen strukturell aufgeklärt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse tragen dazu bei, die Herstellung von PD-Lösung hinsichtlich ihres Gehalts an α-Dicarbonylen zu optimieren und während der Dialyse im Körper ablaufende unerwünschte Reaktionen besser zu verstehen. Die UHPLC-DAD-MS/MS-Methode wurde außerdem auf Lebensmittel ausgeweitet, so dass sechs relevante α-Dicarbonyle in fructosereichem Maissirup und in Erfrischungsgetränken quantifiziert werden konnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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3-Deoxygalactosone, a new glucose degradation product in peritoneal dialysis fluids: identification, quantification by HPLC/DAD/MSMS and its pathway of formation. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2011,399, 1689-97
Mittelmaier, S.; Funfrocken, M.; Fenn, D.; Pischetsrieder, M.
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Analysis of nisin A, nisin Z and their degradation products by LCMS/MS. Food Chemistry 2011, 127, 847-54
Schneider, N.; Werkmeister, K.; Pischetsrieder, M.
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Determination of dideoxyosone precursors of AGEs in human lens proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics 2011,514, 16-26
Linetsky, M.; Kaid Johar, S. R.; Meltretter, J.; Padmanabha, S.; Parmar, T.; Vasavada, A. R.; Pischetsrieder, M.; Nagaraj, R. H.
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Mapping the glycoxidation product Nepsilon-carboxymethyllysine in the milk proteome. Proteomics 2011, 11,420-8
Meyer, B.; Al-Diab, D.; Vollmer, G.; Pischetsrieder, M.
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Multistep ultrahigh performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry analysis for untargeted quantification of glycating activity and identification of most relevant glycation products. Analytical Chemistry 2011,83, 9660-8
Mittelmaier, S.; Pischetsrieder, M.
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Quantification of the six major alpha-dicarbonyl contaminants in peritoneal dialysis fluids by UHPLC/DAD/MSMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2011,401, 1183-93
Mittelmaier, S.; Funfrocken, M.; Fenn, D.; Berlich, R.; Pischetsrieder, M.
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Identification and quantification of six major alpha-dicarbonyl process contaminants in high-fructose corn syrup. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2012, 403, 2923-31
Gensberger, S.; Mittelmaier, S.; Glomb, M. A.; Pischetsrieder, M.
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Analysis of Sugar Degradation Products with alpha-Dicarbonyl Structure in Carbonated Soft Drinks by UHPLC-DAD-MS/MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013, March 11
Gensberger, S.; Glomb, M. A.; Pischetsrieder, M.
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Comprehensive Analysis of Nonenzymatic Post-Translational beta-Lactoglobulin Modifications in Processed Milk by Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013, July 3
Meltretter, J.; Wust, J.; Pischetsrieder, M.
