Proteomische Charakterisierung von krankheitsrelevanten PDZ Domänen und dessen gezielte intrazelluläre Interferenz mittels zell-penetrierender Peptide (CPPs).
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahme des DFG Projektes mit dem Titel „Proteomische Charakterisierung von krankheitsrelevanten PDZ Domänen und dessen gezielte intrazelluläre Interferenz mittels zellpenetrierender Peptide (CPPs)“ haben wir uns auf die Krankheit Mukoviszidose fokussiert, da die Interaktion von PDZ-Domänen mit dem die Krankheit auslösenden Chloridionenkanal die Möglichkeit einer therapeutischen Behandlung eröffnet. Mutationen im CFTR-Gen (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) verursachen die Erbkrankheit Mukoviszidose, die dadurch charakterisiert ist, dass der Wassergehalt des Bronchialsekrets sowie der Sekrete der Bauchspeicheldrüse, der Leber (Galle), der inneren Geschlechtsorgane und akzessorischen Geschlechtsdrüsen sowie des Dünndarms stark erniedrigt ist wodurch diese äußerst zähflüssig werden. Infolge dessen kommt es zu Funktionsstörungen obiger Organe und zu chronischen und schwer behandelbaren Infektionen in der Lunge. Die CFTR-Genmutationen wirken sich auf die Synthese, die Reifung und Funktion des CFTR-Proteins aus. Vermehrter proteosomaler Abbau bei der Reifung und lysosomaler Abbau im Zuge des CFTR-Recyclings reduzieren die Anzahl aktiver CFTR-Chloridionenkanäle in der Plasmamembran mit den oben beschriebenen Folgen. Die Präsenz des CFTR in der Plasmamembran wird über dessen Recycling bestimmt. Im Recyclingprozess führt eine Interaktion mit dem Protein CAL (CFTR-associated ligand) zum lysosomalen CFTR-Abbau wohingegen Interaktion mit den Proteinen NHERF1 und NHERF2 (Na+/H+ exchanger regulatory factors) den CFTR in der Zellmembran stabilisieren. Die Wechselwirkung der Proteine CAL sowie NHERF mit dem CFTR wird über deren PDZ Domänen vermittelt. Die gezielte Blockade der CAL PDZ Domäne sollte den CFTR in der Zellmembran stabilisieren und für einen verbesserten Chloridionenausstrom sorgen. Mittels proteomischer Peptidarrays und weiteren iterativen Optimierungsschritten ist es gelungen zwei Peptide, iCAL36 und iCALL42, zu finden die die CAL PDZ Domäne hochselektiv und mit guter Affinität erkennen. Diese CAL Inhibitoren zeigen die erhoffte Wirkung in speziellen Zelllinien welche eine mutierte Form, die ΔF508-Mutante, des CFTR produzieren. Der CFTR-Chloridionenkanal in der Zellmembran konnte stabilisiert werden was zu einem erhöhten Chloridionentransport führte. Mit sogenannten zellpenetrierenden Peptiden an welche die Inhibitoren iCAL36 und iCALL42 kovalent angeknüpft wurden, lassen sich diese erfolgreich in Zellen einschleusen. Mit der gleichen Methode konnten die Inhibitoren erfolgreich in die Zellen von Rektumbiopsien ex vivo eingeschleust werden. In den Ziellinien konnten wir einen positiven Effekt der Inhibitoren auf die Stabilität des CFTR-Chloridionenkanals in der Membran nachweisen. Im Gegensatz dazu lässt sich ein positiver Effekt der Inhibitoren im Falle der Rektumbiopsien nur durch die Kombination mit einem sogenannten „Korrektor“ erreichen. Die Kombination von Korrektor und CAL-Inhibitor führte zu einer Verbesserung der CFTR Aktivität die ca. 1/3 der CFTR-Aktivität eines gesunden Probanden erreicht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2008): Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjug Chem. 19(12):2363-74
Mueller J, Kretzschmar I, Volkmer R, Boisguerin P
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(2009): Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem. 10(9):1431-42
Volkmer R
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(2010): A stabilizing influence: CAL PDZ inhibition extends the half-life of ΔF508-CFTR. Angew Chem Int Ed Engl. 49(51):9907-11
Cushing PR, Vouilleme L, Pellegrini M, Boisguerin P, Madden DR
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(2010): Engineering peptide inhibitors to overcome PDZ binding promiscuity. Angew Chem Int Ed Engl. 49(51):9912-6
Vouilleme L, Cushing PR, Volkmer R, Madden DR, Boisguerin P
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(2011): Target-oriented peptide arrays in a palliative approach to cystic fibrosis (CF). In: Methods in Protein Biochemistry (ed. Tschesche, H), De Gruyter pp 249-270
Boisguerin P, Madden DR Volkmer R
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US Patent Application Serial No. 13/292,151 / DC0405US.P1 entitelt: “Compositions and methods for inhibiting the interaction between CFTR and CAL”
Dean Madden, Patrick R. Cushing, Prisca Boisguerin, Rudolf Volkmer, Lars Vouilleme
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(2012): The agony of choice: how to find a suitable CPP for cargo delivery. J Pept Sci. 18(5):293-301
Müller J, Triebus J, Kretzschmar I, Volkmer R, Boisguerin P
