Inhibition des Herz-pathogenen Coxsackievirus B3 durch lösliche Virusrezeptor- und RNA Interferenz-basierte Kombinationstherapien
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel des Projektes war die Entwicklung eines antiviralen Ansatzes zur Inhibition des Herz-pathogenen Coxsackievirus B3 (CVB-3). Hierzu sollte eine Kombinationsstrategie entwickelt werden, die aus einer RNA Interferenz-(RNAi-)Komponente und einer Protein-Komponente, der löslichen Domäne des Coxsackievirus Adenovirus Rezeptors (sCAR-Fc), besteht. Die Effizienz der antiviralen Strategie sollte in einem Maus-Myokarditis-Modell untersucht werden. Zunächst sollten beide Komponenten, die RNAi-induzierenden Doppelstrang RNAs und sCAR-Fc von einem einzigen viralen Vektor aus gebildet werden. Obwohl die Funktionalität der hierfür konstruierten artifiziellen microRNAs (amiRNAs) in Reporter-Assays nachgewiesen werden konnte, waren die mit ihnen aufgebauten viralen Vektoren inaktiv. Um dieses Problem zu umgehen, wurde eine Zwei-Vektor-Strategie entwickelt. Zwei short hairpin RNAs (shRNAs) gegen CVB-3 wurden von einem AAV Vektor exprimiert. Für die in vivo-Versuche wurde ein pseudotypisierter AAV2.9 Vektor verwendet, der einen ausgeprägten Herztropismus hat. Für die Expression von sCAR-Fc wurde ein adenoviraler Vektor verwendet, der das Transgenen in der Leber (und anderen Organen) bildet und in den Blutkreislauf abgibt. Die antivirale Wirkung der beiden Vektoren wurde in einem CVB-3-induzierten Maus-Myokarditis- Modell getestet, wobei die Herzen der Tiere umfassend untersucht wurden. Dabei zeigte sich, dass die Viruslast im Herzen bereits durch die Behandlung mit einer der Komponenten signifikant verringert wurde. Die Kombination beider Komponenten hatte eine zusätzliche additive Wirkung, so dass eine weitere signifikante Verstärkung des antiviralen Effektes erzielt werden konnte. Entsprechend der verringerten Viruslast war auch die Entzündung im Herzen sowie die Schädigung des Myokardgewebes durch die Behandlung verringert, wobei die Kombinationstherapie wiederum signifikant besser war als jede der Einzelkomponenten für sich genommen. Schließlich wurden die wichtigsten Parameter der Herzfunktion untersucht. Als Folge der CVB-3-Infektion wird die Herzleistung deutlich verschlechtert. Durch die Behandlung mit den hier entwickelten antiviralen Komponenten konnten der kardiale Ausstoß und die linksventrikuläre Relaxation sowie die linksventrikuläre Kontraktilität signifikant verbessert werden. Wiederum hat eine Kombination des RNAi-Ansatzes mit sCAR-Fc einen signifikant stärkeren Effekt. Somit konnte das Ziel des Projektes erreicht werden, im Tiermodell zu zeigen, dass die Kombination der beiden antiviralen Komponenten der Einzelbehandlung überlegen ist. Diese Strategie soll nun in einem therapeutischen Ansatz statt der hier vorgenommenen prophylaktischen Behandlung eingesetzt werden. Anschließend sollte die Translation der antiviralen Strategie in die klinische Anwendung vollzogen werden. Die Studie ist aber nicht nur im Hinblick auf die Behandlung von CVB-3-Infektionen relevant. Sie ist das erste Beispiel für eine additive antivirale Wirkung bei der Kombination eines RNAi-Ansatzes mit einem Protein-basierten Ansatz, so dass sie auch für andere Virusinfektionen neue Wege für einen Kombinationsansatz zeigen könnte. Weiterhin wurden in mehreren Publikationen des Projektes andere (herzpathogene) Viren inhibiert und die Verwendung viraler Vektoren optimiert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2010) Application of small interfering RNAs modified by unlocked nucleic acid (UNA) to inhibit the heartpathogenic coxsackievirus B3. FEBS Lett 584: 591-598
Werk D, Wengel J, Wengel SL, Grunert HP, Zeichhardt H, Kurreck J
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(2010) Inhibition of adenovirus infections by siRNA- mediated silencing of early and late adenoviral gene functions. Antiviral Res 88: 86-94
Eckstein A, Grossl T, Geisler A, Wang X, Pinkert S, Pozzuto T, Schwer C, Kurreck J, Weger S, Vetter R, Poller W, Fechner H
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(2010) Rapid construction of adeno-associated virus vectors expressing multiple short hairpin RNAs with high antiviral activity against echovirus 30. Oligonucleotides 20: 191-198
Rothe D, Wajant G, Grunert HP, Zeichhardt H, Fechner H, Kurreck J
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(2011) microRNA122-regulated transgene expression increases specificity of cardiac gene transfer upon intravenous delivery of AAV9 vectors. Gene Ther 18: 199-209
Geisler A, Jungmann A, Kurreck J, Poller W, Katus HA, Vetter R, Fechner H, Muller OJ
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(2011) Pharmacological and biological antiviral therapeutics for cardiac coxsackievirus infections. Molecules 16: 8475-8503
Fechner H, Pinkert S, Geisler A, Poller W, Kurreck J
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(2013) A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum Gene Ther Methods 24: 355-363
Wagner A, Rohrs V, Kedzierski R, Fechner H, Kurreck J
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(2013) Adenovirus vector-mediated RNA interference for the inhibition of human parvovirus B19 replication. Virus Res 176: 155-160
Brandt MR, Kirste AG, Pozzuto T, Schubert S, Kandolf R, Fechner H, Bock CT, Kurreck J
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(2015) Combination of RNA Interference and Virus Receptor Trap Exerts Additive Antiviral Activity in Coxsackievirus B3-induced Myocarditis in Mice. J Infect Dis 211: 613-622
Stein EA, Pinkert S, Becher PM, Geisler A, Zeichhardt H, Klopfleisch R, Poller W, Tschope C, Lassner D, Fechner H, Kurreck J
