Structure-function relationship of the type III-secreted protein NopE1 of Bradyrhizobium japonicum
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Bradyrhizobium japonicum ist in der Lage mit verschiedenen Leguminosen eine Wurzelknöllchensymbiose einzugehen. Bei der Interaktion mit den Wirtszellen wird in B. japoncium ein Typ III-Sekretionssystem aktiviert. Die Sekretion einzelner Effektoren beeinflusst die Symbiose mit verschiedenen Wirtspflanzen. Es wurden zwei homologe Proteine NopE1 und NopE2 identifiziert, welche durch das Typ III-Sekretionssystem sekretiert werden und die Interaktion von B. japoncium mit Vigna radiata KPS2 negativ beeinflussen. NopE1 und NopE2 zeigen keine Sequenzähnlichkeit zu bisher bekannten Proteinen. In den Sequenzen wurden je zwei konservierte Domänen unbekannter Funktion (DUF1521) identifiziert. Durch die biochemische Untersuchung der Proteine wurde eine Calcium-induzierbare Selbstspaltungsaktivität nachgewiesen. Die Spaltung der Proteine findet an konservierten GDPH-Motiven statt. Unmittelbar benachbart zu den Spaltstellen wurden in den Sequenzen potenzielle Calcium-Bindemotive vorhergesagt. In diesem Projekt wurde die Lokalisierung des Proteins NopE1 in Knöllchen nach dem Transport durch das Typ III-Sekretionssystem, die Calciumbindung an NopE1 und die Bedeutung der Selbstspaltung in der Interaktion von B. japonicum mit seinen Wirtspflanzen untersucht. NopE1 wurde in Knöllchenextrakten der Pflanze Macroptilium atropurpureum mit Hilfe spezifischer Antikörper detektiert. Das Protein NopE1 wurde durch differentielle Zentrifugation der Knöllchenextrakte in der Fraktion der zytosolischen Proteine nachgewiesen. NopE1 wurde in Knöllchenextrakten als Vollängenprotein, aber auch fragmentiert nachgewiesen. Die Bindung von Calcium an die C-terminale DUF1521-Domäne aus NopE1 konnte in vitro nachgewiesen werden. Sequenzmodifikationen und einzelne Aminosäureaustausche im Bereich einer vorhergesagten Calcium-Bindestelle haben einen deutlichen Einfluss auf die Selbstspaltungsaktivität. Die Funktion von NopE1 und seiner Eigenschaften in der Symbiose wurde in Komplementationsexperimenten mit einer nopE1- nopE2-Doppelmutante untersucht. B. japonicum Wildtyp und die nopE1-nopE2- Doppelmutante zeigen in der Interaktion mit Vigna radiata KPS2 deutlich unterscheidbare Phänotypen. Die Integration eines einzelnen funktionellen Gens nopE1 in die Doppelmutante führte zu Komplementation, und damit zur Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps. Ebenso konnte durch die Integration eines verkürzten nopE1-Gens, welches für den N- Terminus und eine DUF1521-Domäne von NopE1 codiert, der Phänotyp des Wildtyps beobachtet werden. Im Gegensatz dazu bleibt durch die Integration einer nopE1-Variante, die für ein nicht-spaltbares Protein codiert, der Phänotyp der Mutante erhalten. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die in vitro-beobachtete Spaltaktivität von NopE1 auch in vivo eine Bedeutung in der Interaktion besitzt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Deutsches Patent (2009) “Autokatalytischer Proteinlinker und seine Verwendung zur Herstellung von Fusionsproteinen.” Deutsches Patent Nr. 10 2009 008 252
Michael Göttfert, Susanne Zehner, Mandy Wenzel, Lars Friedrich, Jana Schirrmeister
- (2010). The type III-secreted protein NopE1 affects symbiosis and exhibits a calcium-dependent autocleavage activity. Mol. Plant-Microbe Interact. 23, 124-129
Wenzel, M., Friedrich, L., Göttfert, M., Zehner, S.
- (2011) Characterization of the self-cleaving effector protein NopE1 of Bradyrhizobium japonicum. J. Bacteriol. 193, 3733-3739
Schirrmeister, J., Friedrich, L., Wenzel, M., Hoppe, M., Wolf, C., Göttfert, M., Zehner, S.
