Identifizierung und Analyse von Chlamydosporen- und Pathogenitäts-assoziierten Genen in Candida albicans
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die vorliegende Arbeit hat das bislang vergleichsweise geringe Wissen um die morphologische Struktur der Chlamydospore bei den humanpathogen Hefen C. albicans und C. dubliniensis stark bereichert. Es wurden im ersten Teil der Arbeit mittels Microarray- und RNA-Seq-Analysen Gene identifiziert, die unter Chlamydosporenbildung differentiell reguliert wurden. Als Chlamydosporenspezifische Marker wurden zwei der am höchsten exprimierten Gene ausgewählt und mit GFP markiert. Über diese Reporterstämme konnten die Genprodukte schließlich spezifisch und exklusiv in der Zellwand von C. albicans- bzw. C. dubliniensis-Chlamydosporen lokalisiert werden. Weitere putative chlamydosporenassoziierte Gene wurden auf ihre Rolle in der Chlamydosporenbildung, unter verschiedenen Stressen und bei der Bildung komplexer Biofilme untersucht. Durch die Isolierung und Reinigung von Chlamydosporen aus C. dubliniensis war es möglich, die Chlamydosporenwand als besonders chitinreich zu charakterisieren und über Deletionsmutanten die ausgewählten Zielgene teilweise mit dem strukturellen Aufbau der Sporen in Verbindung zu bringen. Das Projektziel der Analyse der Chlamydosporenbildung konnte also erfüllt werden. Im zweiten Teil des Projekts stand die Identifizierung artspezifischer und/oder virulenzassoziierter Gene im Fokus. Mit diesem Ziel wurde eine C. albicans-DNA-Bibliothek in C. dubliniensis unter einer Reihe verschiedener Bedingungen gescreent. Im Zuge der Screenings wurde auch ein Ammonium-mangelmedium (SLAD) neu als C. dubliniensis-spezifischer Chlamydosporeninduktor etabliert. Leider war der initial beobachtete Phänotyp meist nicht auf einzelne Gene zurückzuführen. Auf SLAD-Medium wurde das C. albicans-Gen 19.2115 als Inhibitor der Chlamydosporenbildung in C. dubliniensis identifiziert. Die genaue Rolle des C. albicans Gens 19.2115 wird zurzeit charakterisiert, steht aber sehr wahrscheinlich mit der vermuteten Funktion als tRNA-Threonylcarbamoyladenosin-Dehydratase in neuartiger Verbindung. Zudem gelang es erstmals, den Prozess der Chlamydosporenbildung einem zellulären Signalweg zuzuordnen. Zugabe von Rapamycin verminderte die Chlamydosporenbildung, und viele Gene, die bei einer Deletion zu einem Chlamydosporendefekt führen sind Faktoren im TOR-Signalweg. Eine Deletion von GCN4 in C. albicans beispielsweise bewirkte sowohl in eine erhöhte Rapamycinresistenz als auch in einen absoluten Verlust der Chlamydosporenproduktion. All diese Ergebnisse weisen erstmals auf die Notwendigkeit eines aktiven TOR-Signalweges während der Chlamydosporenbildung in C. albicans und C. dubliniensis hin. Zusätzlich wurde in Umkehrung des ersten Vorgehens eine C. dubliniensis-DNA-Bibliothek in C. albicans auf SLAD gescreent. Die Integration des C. dubliniensis Gens MNN2 in C. albicans induzierte dabei die Produktion von Hyphen unter Konditionen, unter welchen C. albicans ausschließlich in Hefeform wächst. Obwohl MNN2 bereits als hyphenassoziierter Faktor beschrieben ist, konnten wir zeigen, dass die zusätzliche Genkopie die Filamentierung erhöht, was möglicherweise auf einen Gendosiseffekt zurückgeführt werden kann. Damit wurde zum einen die Methode des wechselseitigen Gentausches zwischen diesen eng verwandten Spezies erfolgreich eingesetzt, und zum anderen – darauf basierend – eine mögliche überraschende Verbindung zwischen dem tRNA-Metabolismus und der Morphologie gezeigt. Die Anzahl der gefundenen speziesspezifischen Gene blieb damit zwar hinter den Erwartungen zurück, die Methode war aber insgesamt trotzdem erfolgreich, und die weiter laufenden Untersuchungen dürften bald die genauere Charakterisierung des neuartigen Signalwegs erlauben.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Comparative global transcriptome analysis of Candida albicans and Candida dubliniensis allows new insights into chlamydospore development. VAAM Jahrestagung, Tübingen, Deutschland 2012
Palige K., Linde J., Citiulo F., Sullivan D.J., Rupp S., Morschhäuser J., Hube B., Staib P.
- Identification and Analysis of Morphology- and Virulence-related Genes in Candida dubliniensis. 11th ASM Conference on Candida and Candidiasis, San Francisco, USA 2012
Palige K., Linde J., Citiulo F., Sullivan D.J., Rupp S., Morschhäuser J., Hube B., Staib P.
- Identification of virulence related genes in Candida albicans and Candida dubliniensis by comparative genetic analysis. DGHM Jahrestagung, Hamburg, Deutschland 2012
Böttcher B., Palige K., Shelest E. Staib P.
- Global transcriptome sequencing identifies chlamydospore specific markers in Candida albicans und Candida dubliniensis. PLoS One. 2013 Apr 15;8(4):e61940
Palige K, Linde J, Martin R, Böttcher B, Citiulo F, Sullivan DJ, Weber J, Staib C, Rupp S, Hube B, Morschhäuser J, Staib P
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061940) - Identification of species-specific genes in Candida albicans and Candida dubliniensis. DGHM Jahrestagung, Rostock, Deutschland 2013
Böttcher B., Brunke S., Staib P., Hube B.
- Molecular cross-species approaches to elucidate virulence-related traits of Candida albicans. 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis, New Orleans;USA 2014
Böttcher B., Brunke S., Staib P., Hube B.
