Funktionelle Charakterisierung von Proteinen der Zuckerrübe die mit dem Pathogenitätsfaktor P25 des beet necrotic yellow vein virus interagieren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die viröse Wurzelbärtigkeit hervorgerufen durch das Benyvirus - Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) wird durch resistente Genotypen kontrolliert, wobei der zugrunde liegende Resistenzmechanismus unverstanden ist. Das von der RNA3 des BNYVV kodierte Genprodukt P25 ist für die Translokation des Virus im Wurzelsystem und die Symptomausprägung in anfälligen Zuckerrübengenotypen verantwortlich. Im Rahmen der Durchmusterung einer Zuckerrüben cDNA Expressionsbibliothek mit P25 wurde eine Vielzahl von Interaktionspartnern identifiziert. Daher wurde in diesem Forschungsvorhaben versucht, 15 Kandidaten vollständig zu isolieren und im Detail zu charakterisieren. Dafür wurden verschiedene Proteininteraktionssysteme – „Yeast-two hybrid“, „Bimolecular fluorescence complementation“ und GST-„pull down“ zur Protein-Protein Interaktion mit P25 ausgewählt. Ein als F-box identifiziertes Protein zeigte nach transienter agrovermittelter Expression in N. benthamiana eine Blattnekrose. Dieser durch F-box vermittelte Zelltod konnte als Hypersensitive Reaktion durch den Nachweis von PR-Proteinen bestätigt werden. F-box Proteine sind an der Proteindegradation als Komplexproteine der E3 Ligase (SKP1- Cullin1-F-box [SCF-] Komplex) identifiziert worden und binden durch bestimmte Proteindomänen Zielproteine, die am 26S Proteasom abgebaut werden. Des Weiteren konnte die F-box Expression auf mRNA Ebene in BNYVV infizierten und gesunden Wurzelgewebe nachgewiesen werden. Auch wurde die Protein-Protein Interaktion durch Ko- Lokalisation in denselben Zellkompartimenten (Kern und Zytoplasma) mittels Fluoreszenzmarkierung mit GFP und mRFP nachgewiesen. Die Untersuchung im YTH mit einem „bridge Vektor“ konnte final zeigen, dass P25 in einem direkten Zusammenhang mit F-box und dem SCF-Komplex steht. All diese Ergebnisse lassen vermuten, dass P25 und die Interaktion mit F-box einen bisher ungeklärten Vorteil für BNYVV haben, da F-box einen wesentlichen Einfluss auf die Auswahl der für die Degradation ausgewählten Proteine hat. Ein weiterer Kandidat konnte als Auxin-Transkriptionsfaktor (Bv-IAA) aus Zuckerrübe identifiziert werden. Es ist bekannt, dass erhöhte Auxingehalte in BNYVV infizierten anfälligen Zuckerrüben zu beobachten sind und somit einen Einfluss auf die Symptomausprägung haben. Nach Bestätigung der P25-Bv-IAA Interaktion in verschiedenen Testsystemen wurde mittels Northern Blot nachgewiesen, dass die Bv-IAA Expression in anfälligen und resistenten Zuckerrübengenotypen durch BNYVV Infektion verstärkt wird. Im Rahmen von anschließenden Ko-Lokalisationsanalysen konnte zusätzlich demonstriert werden, dass P25, dessen subzelluläre Verbreitung als „Shuttling“ Protein zwischen Kern und Zytoplasma beschrieben ist, die Lokalisation von Bv-IAA vom Kern ins Zytoplasma verändert. Des Weiteren hat Bv-IAA einen Einfluss auf die Lokalisation einer P25 Mutante, mit Defekt im Kernlokalisationssignal, die nicht mehr im Zellkern detektierbar war. Bei Ko- Expression mit Bv-IAA war das defekte P25 ausschließlich im Zellkern mit Bv-IAA zu finden. Das Aux/IAAs einen Einfluss auf Zellwachstum und -differenzierung haben ist seit langem bekannt; somit bleibt die Vermutung, dass die P25-Bv-IAA Interaktion Einfluss auf die erhöhten Auxingehalte in infizierten Pflanzen hat und durch dieses Phytohormonungleichgewicht die Bildung von vermehrtem Seitenwurzelwachstum durch BNYVV Infektion zur Folge hat. Diese Beobachtungen unterstützen die biologische Relevanz der Interaktion des BNYVV Pathogenitätsfaktors P25 mit den untersuchten Kandidaten aus Zuckerrübe. Final bleibt zu bemerken, dass der zugrunde liegende Mechanismus der BNYVV Resistenz ungeklärt bleibt, jedoch neue Erkenntnisse über die Interaktion von P25 mit Zuckerrübenproteinen gewonnen werden konnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012) Faktoren der Stabilität von Rizomaniaresistenz in Zuckerrüben/Stability factors of rhizomania resistance in sugar beet. Sugar Industry/Zuckerindustrie, 4, 234-242
Bornemann, K. & Thiel, H.
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(2012) The P25 pathogenicity factor of Beet necrotic yellow vein virus targets the sugar beet 26S proteasome involved in the induction of a hypersensitive resistance response via interaction with an F-box protein. Molecular Plant Microbe Interactions, 8, 1058-1072
Thiel, Heike; Hleibieh, Kamal; Gilmer, David & Varrelmann, Mark
