Einsatz von Scaffolds auf der Basis von schnell resorbierbaren Calciumalkaliorthophosphaten zur Knochenregeneration segmentaler Defekte in der Kieferchriurgie und zahnärztlichen Implantologie mittels Tissue Engineering
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Herstellung von 3D Scaffolds aus zu versinternden Calciumphosphatkeramiken mit der Hauptkristallphase, Ca2KNa(PO4)2, die auf einem Schmelzprodukt als Ausgangsbasis beruhen, stellte eine technische Herausforderung dar, während für Polymere diverse Verfahren zur Verfügung stehen. Im vorliegenden Vorhaben konnten das Know-how erarbeitet werden für die Herstellung der erforderlichen Ausgangsformen, d. h. Ausgangsgranulate und Schlicker aus einem Calciumalkaliorthophosphat-Schmelzprodukt für die Fertigung von 3D Scaffolds mittels 3D Printing und einer Replikatechnik. Dies beinhaltete die Einführung eines Sinterhilfsmittels sowie verfahrensspezifische Schlicker- und Granulatentwicklungen. Dabei konnte ein 3D Druckverfahren für diese Keramiken entwickelt werden, welches die Herstellung von 3D Scaffolds mit kontrollierter Porengröße und Interkonnektivität ermöglicht. Die Ergebnisse sowohl der in vitro Untersuchungen zur Kultivierung dieser Scaffolds mit osteogen differenzierten mesenchymalen Stammzellen als auch die Ergebnisse der in vivo Implantation, zeigten, dass für die gleichmäßige Durchsetzung der Scaffoldporen m it Osteoblasten und extrazellulärer Matrix sowie für die Knochenbildung und Vaskularisation in vivo nicht die Gesamtporosität sondern die Verteilung von Mikro-, und Makroporen im Scaffold ausschlaggebend ist. Weiterhin konnte im vorliegenden Vorhaben unter Einsatz eines kommerziell erhältlichen und programmierbaren Perfusionsbioreaktors ein Verfahren entwickelt werden, welches eine gleichmäßige Durchsetzung der Poren von Scaffolds mit Zellen ermöglicht und die Differenzierung dieser Zellen zu terminal differenzierten Osteoblasten mit Bildung von mineralisierender Knochenmatrix, welche die Scaffolds homogen durchsetzt nach nur 7d Kultivierdauer. Die Ergebnisse der in vitro Pilotstudie zeigten, dass trotz geringerer Gesamtporosität bei aber höherer Mikroporosität die 3D gedruckten Scaffolds eine verstärkte Besiedlung mit Zellen und höhere Matrixbildung bei gesteigertem Differenzierungsniveau bedingten. Gleichzeitig wiesen die 3D gedruckten Scaffolds eine höhere Abgabe von Calcium- und Siliziumionen in Verbindung mit dem Vorliegen einer höheren Druckfestigkeit auf im Vergleich zu den mit Replikatechnik gefertigten Scaffolds. Eine weitere Herausforderung stellt das Erreichen einer adäquaten Vaskularisierung beim Einsatz von Maßnahmen des Tissue Engineerings zur Regeneration segmentaler Defekte dar. Im vorliegenden Vorhaben konnte eine mikrovaskuläre Technik nach dem Prinzip der intrinsischen Angiogenesekammer für die Anwendung bei Implantation von mit Zellen kolonisierten Implantatscaffolds entwickelt werden und gezeigt werden, dass unter Einbringung eines arteriovenösen Bündels in den Defekt eine hohe Vaskularisierung erreicht werden kann, die bei der Verwendung der 3D gedruckten Scaffolds höher war als bei den mit Replikatechnik gefertigten, was darauf hinwies, dass ebenfalls für die Vaskularisierung die Verteilung von Mikro- und Makroporen ausschlaggebender war als die Gesamtporosität. Darüber hinaus konnte ein Mikroangio-CT Verfahren in Zusammenarbeit mit Dr. M. Kampschulte, Radiologie Giessen, für die vorliegende Anwendung erarbeitet werden, welches eine detaillierte Charakterisierung und Quantifizierung der Vaskularisierung ermöglichte. Die Ergebnisse zeigten, dass bei Verwendung der 3D gedruckten Scaffolds die höchste Vaskularisierung bei höchster Gefäßreifung vorlag. Dies wurde durch den immunhistochemischen Befund der angiogenen Markerexpression bestätigt. Die Befunde gaben weiterhin Anlass zu der Vermutung, dass die verwendete siliziumhaltige Calciumalkaliorthophosphatkeramik mit der Hauptkristallphase, Ca2KNa(PO4)2, deren hervorragenden osteogenen Eigenschaften bereits in den vorausgegangenen DFG-Projekten belegt werden konnten, auch die Angiogenese fördernde Eigenschaften aufzuweisen scheint. Die verschiedenen Untersuchungen zur Knochenbildung zeigten, dass bei Verwendung der 3D gedruckten Scaffolds in Verbindung mit Zellkolonisation und mikrovaskulärem Bündel vergesellschaftet mit der höchsten Vaskularisierung auch die höchste Knochenbildung erreicht werden konnte. Nach 6 Monaten war die Restitutio der originalen Mikroanatomie der Röhrenknochenstruktur jedoch noch nicht vollständig abgeschlossen, weswegen die Untersuchung von längeren Liegezeiten für die Variante 3D gedruckte Scaffolds mit Zellkolonisation und mikrovaskulärem Bündel wünschenswert ist sowie die Bestätigung der vorliegenden Ergebnisse im Großtiermodell und bei Unterkieferdefekten. Weiterhin zeigten die Befunde, dass die Knochenbildung nicht nur von den Defektenden sondern auch vom Inneren der Scaffolds auszugehen schien, was die Vermutung aufwirft, dass die vorliegende Calciumalkaliorthophosphatkeramik sogar osteoinduktive Eigenschaften haben könnte, was in einem ektopischen Defektmodell zu überprüfen wäre. Die erarbeiteten Resultate sind von hoher wissenschaftlicher und klinischer Bedeutung, da klinische Studien mit Einsatz von BMP abgebenden Knochenersatzmaterialien zeigen, dass diese die knöcherne Regeneration und Konsolidierung von ausgedehnten Oberkieferknochendefekten bei jugendlichen Spaltpatienten bewirken können. Jedoch beim Einsatz dieser Biomaterialien bei segmentalen Mandibuladefekten bei erwachsenen sich in mittleren Lebensalter befindenden Tumorpatienten eine langfristige knöcherne Konsolidation ausblieb oder sich diese entsprechenden tissueengineerten Konstrukte wieder lösten, so dass die Entwicklung von Ansätzen unter Verzicht von BMPs und ähnlicher Wachstumsfaktoren weiterhin wichtig ist.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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- Developments in High Resolution CT - Studying bioregeneration by hard X-ray synchrotron based microtomography. In: “Comprehensive Biomaterials”, Volume 3, Chapter 3.304. P. Ducheyne, K. Healy, D. Hutmacher, D.W. Grainger, J.P. Kirkpatrick, editors. Elsevier, Oxford, UK, 2011, p. 47-62
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