Untersuchungen zur Lokalisation, Topologie, Membranverankerung, Sezernierung und Funktion des pestiviralen Strukturglykoproteines Ems
Virologie
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Pestiviren induzieren Krankheiten, die zu den ökonomisch wichtigsten Syndromen landwirtschaftlicher Nutztieren gehören. Eine auffällige Eigenschaft von Pestiviren ist ihre Fähigkeit, lang anhaltende persistierende Infektionen zu etablieren. Diese langwierige Persistenz bedarf einer Repression der Virus-spezifischen Immunantwort des Wirtes. Im Rahmen des vorliegenden Projektes konnten wir zeigen, dass zwei pestivirale Proteine, die vorher als Inhibitoren der angeborenen Immunantwort beschrieben worden waren, entscheidend für die Persistenz sind. Diese beiden Proteine, Npro und Erns, sorgen zusammen dafür, dass im persistent infizierten Tier keine messbare Typ 1 Interferonantwort erfolgt. Im vorliegenden Projekt wurde das Erns Protein detailliert charakterisiert. Erns besitzt eine RNase Aktivität, die für seine Rolle als Virulenzfaktor und unterstützende Komponente bei der Persistenz essentiell ist. Erns wird von infizierten Zellen sekretiert und zirkuliert im infizierten Tier unabhängig vom Virus, was zu der Hypothese geführt hat, dass das sekretierte Protein den eigentlichen Virulenzfaktor darstellt. Da Erns aber zudem auch eine essentielle Komponente infektiöser Pestiviruspartikel darstellt, muss der überwiegende Teil des nach Infektion gebildeten Proteins in der Zelle zurückgehalten werden. Wir konnten in unseren Arbeiten zeigen, dass dieses komplexe Verhalten des Erns im Zusammenhang mit seinem ungewöhnlichen Membrananker steht. Erns ist das bisher einzige (virale) Oberflächenprotein, das über eine lange amphiphile Helix an die Membran gebunden ist. Wir konnten die Abhängigkeit der Membranverankerung des Proteins von der Integrität der amphipilen Helix nachweisen und deren Struktur mittels NMR Analysen in Kooperation mit unseren Partnern ermitteln. Trotz dieser ungewöhnlichen, planar zur Membranoberfläche ausgerichteten Struktur wird der Carboxyterminus des Erns durch die zelluläre Signalpeptidase generiert, womit dieses Protein eine absolute Sonderstellung einnimmt. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass der Membrananker auch die Informationen enthält, die für die intrazelluläre Retention des Erns im Bereich des ERs bedingt und konnten das fragliche Signal auf wenige Aminosäuren eingrenzen. Bindungsstudien mit verschieden zusammengesetzten Lipidvesikeln führten zu dem Ergebnis, dass die zuvor in Zellen beobachtete Störung der Membranbindung und intrazellulären Retention von Erns Membranankermutanten nicht auf eine grundsätzlich stark eingeschränkte Fähigkeit zur Lipidbindung zurückzuführen ist. Daraus folgte die Hypothese, dass die Interaktion des Erns Membranankers mit zellulären Molekülen wesentlich für die beobachteten Funktionen verantwortlich sein müsste. Bisherige Versuche zur Identifizierung solcher zellulären Interaktionspartner führten zu keinen klaren Erkenntnissen. Somit stellt die Bestimmung solcher Bindungspartner eine spannende Frage für zukünftige Arbeiten dar. Gleiches gilt für die Aufklärung des Phänomens, dass viele Veränderungen des Membranankers die Bildung infektiöser Viruspartikel verhindern, auch wenn deren Auswirkungen auf die Membranbindung und intrazelluläre Retention marginal sind. Dies gilt insbesondere für die Austausche von bei Pestiviren konservierten geladenen Aminosäuren, die ursprünglich für die Ausbildung eines sog. ‚charge zippers‘ vorgeschlagen wurden. Hinweise auf die Bildung einer ‚charge zipper‘ Haarnadelstruktur konnten in unseren Analysen nicht bestätigt werden. Die Mechanismen, die dazu führen, dass Erns als Virulenzfaktor fungiert, sind bisher weitgehend unverstanden. Wir konnten aber zeigen, dass die Fähigkeit des Proteins Disulfid-verbundene Homodimere zu bilden, entscheidend an dieser Funktion beteiligt ist. Dies ergab sich aus Tierstudien mit Virusmutanten, die keine Dimere mehr bilden können. Bei solchen Versuchen konnten wir eine interessante Pseudorevertante identifizieren, die eine Dimerisierung über ein durch Mutation erzeugtes Cystein innerhalb der Membranankersequenz erreichte. Daraus ergaben sich neue Fragestellungen für weitere Arbeiten zu den strukturellen Voraussetzungen für die Dimerbildung. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass wir das Wissen um die biochemischen und zellbiologischen Eigenschaften des Erns Proteins erheblich steigern und interessante Ansätze für weitere Forschungsarbeiten erarbeiten konnten.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- 2005. The carboxy-terminal sequence of the pestivirus glycoprotein Erns represents an unusual type of membrane anchor. J. Virol. 79: 11901-11913
Fetzer, C., Tews, B.A., and Meyers, G.
- 2007. Bovine viral diarrhea virus: prevention of persistent fetal infection by a combination of two mutations affecting Ems RNase and Npro protease. J. Virol. 81:3327-3338
Meyers, G., Ege, A., Fetzer, C., von Freyburg, M., Elbers, K., Carr, V., Prentice, H., Charleston, B., and Schürmann, E.-M.
- The pestivirus glycoprotein Ems is anchored in plane in the membrane via an amphipathic helix. 2007. JBC 282:32730-32741
Tews, B.A. and Meyers, G.
- 2009. Mutation of cysteine 171 of pestivirus Ems RNase prevents homodimer formation and leads to attenuation of classical swine fever virus. J. Virol. 83:4823-4834
Tews, B.A., Schürmann, E.-M., and Meyers, G.
- 2010. A New Type of Signal Peptidase Cleavage Site Identified in an RNA Virus Polyprotein. JBC 285:8572-8584
Bintintan, I. and Meyers, G.
- 2011. Basic science paves the way to novel safe and effective pestivirus vaccines. In: Dormitzer, P.R., Mandl, C.W. and Rappuoli (Eds.). Replicating Vaccines, a new Generation. Springer, Basel Switzerland, pp. 173-194
Tautz, N., and Meyers, G.
- 2011. Viral RNase involvement in strategies of infection. In: Nicholson, A.W. Ribonucleases. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, Germany, pp. 135-166
Meyers, G., Rümenapf, T., and Ziebuhr, J.
- 2012. A new type of intracellular retention signal identified in a pestivirus structural glycoprotein. FASEB J.26:3292-3305
Burrack, S., Aberle, D., Bürck, J., Ulrich, A.S. and Meyers, G.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1096/fj.12-207191) - 2014. Structure of the membrane anchor of pestivirus glycoprotein Erns, an amphipathic helix with an unusual membrane topology. PLoS Pathogens, 10:e1003973
Aberle, D., Muhle-Goll, C., Bürck, J., Luy, B., Ulrich, A.S., and Meyers G.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003973) - 2015. Lipid Binding of the Amphipathic Helix Serving as Membrane Anchor of Pestivirus Glycoprotein Erns. PLoS ONE 10: e0135680
Aberle, D., Oetter, K.-M., and Meyers G.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0135680) - 2015. The Molecular Biology of Pestiviruses. Adv. Virus Res. 93:47-160
Tautz N, Tews BA, Meyers G
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/bs.aivir.2015.03.002)
