Analysis of localization, topology, membrane binding, secretion and function of the pestivirus structural glacoprotein Erns
Virology
Cell Biology
Final Report Abstract
Pestiviren induzieren Krankheiten, die zu den ökonomisch wichtigsten Syndromen landwirtschaftlicher Nutztieren gehören. Eine auffällige Eigenschaft von Pestiviren ist ihre Fähigkeit, lang anhaltende persistierende Infektionen zu etablieren. Diese langwierige Persistenz bedarf einer Repression der Virus-spezifischen Immunantwort des Wirtes. Im Rahmen des vorliegenden Projektes konnten wir zeigen, dass zwei pestivirale Proteine, die vorher als Inhibitoren der angeborenen Immunantwort beschrieben worden waren, entscheidend für die Persistenz sind. Diese beiden Proteine, Npro und Erns, sorgen zusammen dafür, dass im persistent infizierten Tier keine messbare Typ 1 Interferonantwort erfolgt. Im vorliegenden Projekt wurde das Erns Protein detailliert charakterisiert. Erns besitzt eine RNase Aktivität, die für seine Rolle als Virulenzfaktor und unterstützende Komponente bei der Persistenz essentiell ist. Erns wird von infizierten Zellen sekretiert und zirkuliert im infizierten Tier unabhängig vom Virus, was zu der Hypothese geführt hat, dass das sekretierte Protein den eigentlichen Virulenzfaktor darstellt. Da Erns aber zudem auch eine essentielle Komponente infektiöser Pestiviruspartikel darstellt, muss der überwiegende Teil des nach Infektion gebildeten Proteins in der Zelle zurückgehalten werden. Wir konnten in unseren Arbeiten zeigen, dass dieses komplexe Verhalten des Erns im Zusammenhang mit seinem ungewöhnlichen Membrananker steht. Erns ist das bisher einzige (virale) Oberflächenprotein, das über eine lange amphiphile Helix an die Membran gebunden ist. Wir konnten die Abhängigkeit der Membranverankerung des Proteins von der Integrität der amphipilen Helix nachweisen und deren Struktur mittels NMR Analysen in Kooperation mit unseren Partnern ermitteln. Trotz dieser ungewöhnlichen, planar zur Membranoberfläche ausgerichteten Struktur wird der Carboxyterminus des Erns durch die zelluläre Signalpeptidase generiert, womit dieses Protein eine absolute Sonderstellung einnimmt. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass der Membrananker auch die Informationen enthält, die für die intrazelluläre Retention des Erns im Bereich des ERs bedingt und konnten das fragliche Signal auf wenige Aminosäuren eingrenzen. Bindungsstudien mit verschieden zusammengesetzten Lipidvesikeln führten zu dem Ergebnis, dass die zuvor in Zellen beobachtete Störung der Membranbindung und intrazellulären Retention von Erns Membranankermutanten nicht auf eine grundsätzlich stark eingeschränkte Fähigkeit zur Lipidbindung zurückzuführen ist. Daraus folgte die Hypothese, dass die Interaktion des Erns Membranankers mit zellulären Molekülen wesentlich für die beobachteten Funktionen verantwortlich sein müsste. Bisherige Versuche zur Identifizierung solcher zellulären Interaktionspartner führten zu keinen klaren Erkenntnissen. Somit stellt die Bestimmung solcher Bindungspartner eine spannende Frage für zukünftige Arbeiten dar. Gleiches gilt für die Aufklärung des Phänomens, dass viele Veränderungen des Membranankers die Bildung infektiöser Viruspartikel verhindern, auch wenn deren Auswirkungen auf die Membranbindung und intrazelluläre Retention marginal sind. Dies gilt insbesondere für die Austausche von bei Pestiviren konservierten geladenen Aminosäuren, die ursprünglich für die Ausbildung eines sog. ‚charge zippers‘ vorgeschlagen wurden. Hinweise auf die Bildung einer ‚charge zipper‘ Haarnadelstruktur konnten in unseren Analysen nicht bestätigt werden. Die Mechanismen, die dazu führen, dass Erns als Virulenzfaktor fungiert, sind bisher weitgehend unverstanden. Wir konnten aber zeigen, dass die Fähigkeit des Proteins Disulfid-verbundene Homodimere zu bilden, entscheidend an dieser Funktion beteiligt ist. Dies ergab sich aus Tierstudien mit Virusmutanten, die keine Dimere mehr bilden können. Bei solchen Versuchen konnten wir eine interessante Pseudorevertante identifizieren, die eine Dimerisierung über ein durch Mutation erzeugtes Cystein innerhalb der Membranankersequenz erreichte. Daraus ergaben sich neue Fragestellungen für weitere Arbeiten zu den strukturellen Voraussetzungen für die Dimerbildung. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass wir das Wissen um die biochemischen und zellbiologischen Eigenschaften des Erns Proteins erheblich steigern und interessante Ansätze für weitere Forschungsarbeiten erarbeiten konnten.
Publications
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