Live Cell Imaging System für konfokale und Multiphotonen In-vivo Mikroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Gerät wird im Wesentlichen im Rahmen der Core Facility “konfokale und Multiphotonen Mikroskopie” der medizinischen Fakultät der Universität Ulm eingesetzt. Aktuell arbeiten mehr als 10 verschiedene Forschergruppen, vor allem aus dem Bereich der Universität Ulm mit dem Gerät. Die wichtigsten Arbeiten seien kurz zusammengefasst: 1) Alterungsprozesse hematopoetischer Stammzellen: Aufgrund des Alterungsprozesses hematopoetischer Stammzellen (HSCs) ist die Bildung von Blutzellen im Alter beeinträchtigt. Obwohl zahlreiche Untersuchungen das Altern der HSCs beschreiben, ist der genaue molekulare Mechanismus weitestgehend unbekannt. Um das Altern der Stammzellen aufzuhalten ist jedoch eine genaue Kenntnis des Mechanismus notwendig. Die Arbeiten von Prof. Geiger und seiner Arbeitsgruppe konnten in diesem Zusammenhang zeigen, daß eine erhöhte Aktivität der kleinen RhoGTPase Cdc42 in gealterten HSCs mit dem Altern zusammenhängt und mit einem Verlust der Polarität dieser Zellen. Wird nun die Cdc42 Aktivität pharmakologisch inhibiert, werden die gealterten HSCs verjüngt, der Anteil polarisierter Zellen nimmt zu und die Acetylierung des Histon H4 Proteins am Lysin 16 entspricht wieder dem junger HSCs. Darüberhinaus wurde eine unerwartete Verlagerung von einem kanonischen zu einem nicht kanonischen Cdc42-Wnt5a Signalweg in gealterten HSCs beobachtet, der auf einer erhöhten Expression von Wnt5a beruht. Wird die Wnt5a Expression reduziert, entstehen verjüngte HSCs. Mit Hilfe des LSM 710 Mikroskops der Core Facility konnte die 3 dimensionale Verteilung von Cdc42, Wnt5a sowie der Acetylierung des Proteins Histon H4 Lysin 16 beobachtet werden. 2) Mechanismen der Metastasenbildung: Die Arbeitsgruppe von Prof. Seufferlein beschäftigt sich mit den grundlegenden Mechanismen der Metastasenbildung von Tumorzellen und ihrer Kontrolle durch Serin/Threonin Kinasen der Protein Kinase D Familie. Die Funktion einzelner PKD Isoformen werden während der Entwicklung von Pankreas- und Darmkrebs untersucht. Insbesondere Änderungen im Aktin Zytoskelett und der Zusammenhang mit Zell Motilität, Zell-Zell und Zell-Substrat Interaktionen werden untersucht. Ein weiteres Interesse der Arbeitsgruppe sind Sekretionsprozesse und der Transport von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), die zur Zerstörung der extrazellulären Matrix führen. Hier ist insbesondere interessant wie PKDs die Sekretionsprozesse kontrollieren und die Carrier Bildung und Spaltung durch ein Netzwerk an Proteininteraktionen des Trans-Golgi Netzwerks reguliert wird. 3) Untersuchungen zum Zellmetabolismus: Die Arbeitsgruppe von Prof. von Arnim sowie die Arbeitsgruppe von Dr. Rück untersuchen mit neuesten FLIM Techniken den Zellmetabolismus bei verschiedenen Krankheiten. Die Arbeitsgruppe von Frau von Arnim ist insbesondere interessiert, den mitochondrialen Metabolismus bei neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer Demenz aufzuklären. Die Gruppe von Frau Rück beschäftigt sich mit der Korrelation des Zellmetabolismus mit der Tumorprogression. In beiden Fällen wird die NADH und Flavin Fluoreszenz zeitaufgelöst analysiert und über die Fluoreszenzabklingzeit der glykolytische und mitochondriale Metabolismus differenziert. 4) Erforschung der Entstehung von AA Amyloidose: Die Arbeitsgruppe von Dr. Aumüller (Pharmakologische Biotechnologie) nutzt fluoreszenzspektroskopische Techniken um die Amyloidbildung des Serum Amyloid A (SAA) Proteins, welches am Krankheitsgeschehen der AA Amyloidose maßgeblich beteiligt ist, im Detail zu verstehen. Insbesondere interessieren die Vorgänge in der lebenden Zelle, die mit den konfokalen Mikroskopietechniken untersucht werden. Dazu wird eine J774A.1 Zellkultur verwendet, der ein Gemisch aus wild-typ und Donor- sowie Akzeptor-markiertem SAA zugesetzt wird. Nach Aufnahme der Proteine durch die Zellen lässt sich jetzt die Bildung des Amyloids in der Zelle mit Hilfe von FRET verfolgen. Dieses Modellsystem erlaubt weiterhin die Untersuchung der Proteolyse von SAA, die mit der Abspaltung der Fluoreszenzlabel verbunden ist. 5) Design-Optimierung von Nanotherapeutika: Krebszell-spezifische „Adressierung“ von Wirkstoffen erhöht Effizienz in der experimentellen Tumortherapie" Wissenschaftler des ILM und der Universität Ulm (Institut für anorganische Chemie II, Institut für Naturheilkunde und klinische Pharmakologie) konnten in internationaler Zusammenarbeit mit Kollegen der Universität Turku (Finnland) zeigen, dass Therapeutika-befüllte Nanoträger aus mesoporösem Siliziumoxid, deren Oberflächen mit Folsäure-Molekülen bestückt wurden, in Tumoren mit Folsäure-Rezeptormolekülen eine verstärkte Wirkung aufweisen. Tumore, denen der Folsäure-Rezeptor fehlt, wurden durch die mittels Folsäure adressierten Therapeutika hingegen deutlich weniger effizient im Wachstum gehindert. Im Rahmen dieser Studien unterstützte die Core Facility Konfokale und Multiphotonen-Mikroskopie das Projekt durch Studien zur Lokalisation und Frachtfreisetzung von Nanoträgern in ex vivo Präparaten von Tumortransplantaten auf der Chorioallantoismembran des befruchteten Hühnereis (CAM-Modell). 6) Zelluläre Mechanismen der Alzheimer Demenz: Die Projekte der AG von Arnim an der Core-Facility Mikroskopie befassen sich mit den zellulären Mechanismen der Alzheimer Demenz. Ziel ist es, die Regulation des APP- und BACE1-Transports innerhalb der Zelle sowie die Auswirkungen auf den Zellmetabolismus zu analysieren. Im Rahmen dieser Projekte wurden mittels konfokaler Mikroskopie im life-cell imaging Verfahren der Einfluss von Transport- und Adapterproteinen (z.B. GGA, GULP, PICALM) auf die Verteilung und Lokalisation von APP oder BACE1 untersucht. Aktuelle Arbeiten beschäftigen sich außerdem mit dem Licht-konvertierbaren Fluoreszenzprotein mEOS. Mit Hilfe von mEOS sollen die zeitliche und räumliche Verfolgung des APP und BACE1 Transports, vor allem in neuronalen Kulturen ermöglicht werden. Des Weiteren wird im Rahmen einer Kooperation mit einem Industriepartner der Einfluss von APP auf Morphologie und Vitalität von Neuronen untersucht.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Cdc42 activity regulates hematopoietic stem cell aging and rejuvenation. Cell Stem Cell 10, 520-30 (2012)
Florian, M.C. et al.
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Evaluation of photodynamic treatment using Aluminum PhthalocyanineTetrasulfonate Chloride as a photosensitizer: New approach. Photochem. Photobiol. Sci., 11, 1156-1163 (2012)
R.M. Amin, C. Hauser, I. Kinzler, C. Scalfi-Happ, A. Rueck
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(2013): Cell metabolism, tumour diagnosis and multispectral FLIM. Proc. SPIE (2013)
Rueck A, Hauser C, Lorenz S, Mosch S, Rotte S, Kessler M, Kalinina S
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A canonical to non-canonical Wnt signalling switch in haematopoietic stem-cell ageing. Nature 503, 392-6 (2013)
Florian, M.C. et al.
