Lysosomes in Drosophila melanogaster: Characterization of key components and analysis of their impact for neuronal development.
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die erstmalige Untersuchung und Charakterisierung von Schlüsselkomponenten der Lysosomen in Drosophila zeigte, dass Gemeinsamkeiten aber auch unerwartete Unterschiede zu den bekannten Proteinen der Säuger bestehen. 1. LERP-Sortierungsrezeptor: LERP ist zum M6P/lGFII-Rezeptor der Säuger homolog und sortiert lysosomale Hydrolasen der Säuger zu deren Lysosomen, unabhängig von Mannose-6-Phosphat und anderen Zuckerresten (bisher 406 getestet), was auf ein peptidabhängiges, Spezies-übergreifendes Erkennungsmotiv hindeutet. Die Proteasen aus Drosophila werden über LERP zu den Lysosomen sortiert, während die sauren Glykosidasen aus Drosophila anders als bei den Säugern überwiegend extrazellulär lokalisiert sind, und nicht über LERP sortiert werden. Die Ausschaltung von LERP in Fliegen (Knockdown durch RNAi) ist semi-letal. Es wurde eine Fehlsortierung der Cathepsine L und Bl nachgewiesen, mit extrazellulärer Akkumulation der Cathepsin-Proformen sowie eine Zunahme ubiquitinylierter Proteine. 2. Ausschaltung des GGA-Adaptors in Drosophila melanogaster: Das GGA-Protein ist als Sortierungsadaptor daran beteiligt, dass die lysosomalen sauren Hydrolasen der Zellen mittels eines Transportproteins in die Lysosomen gelangen, um beim dortigen sauren pH-Optimum Substrate abzubauen. Wir konnten das einzige GGA-Protein zum erslen Mal in einem Organismus ausschalten (Drosophila-Fliegen / RNAi/ UAST-System), mit dem Ergebnis eines letalen Phänotyps (GGA-KD-Fliege). Nach Untersuchung der Cysteinproteasen Cathepsin L und Bl ergab sich folgender Befund: Die Fliegenlarven sterben im frühen Puppenstadium, wenn entwicklungsbedingt ein massiver Proteinabbau durch Autophagosomen erfolgt, der lysosomale Proteinabbau ist gestört und ein massiver Anstieg abzubauender, ubiquitinylierter Proteine ist nachweisbar. Als Folge der aus dem GGA-Verlust resultierenden Fehlsortierung der untersuchten Proteasen sind die Lysosomen nicht mit Proteasen ausgestattet. Die Ausstattung der Autophagosomen mit lysosomalen Hydrolasen kann nicht erfolgen, die Proteinsubstrate werden nicht abgebaut. Die Ausschaltung von GGA im Fliegenauge führt mit zunehmendem Alter zur Deorganisation der Photorezeptorzellen, Ubiquitin-Einschlüsse sind nachweisbar. Nach jüngsten Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen arbeiten die alternativen abbauenden Systeme der Zellen, wie Proteasomen, nicht wie bisher angenommen unabhängig, sondern können durch Störungen in den anderen abbauenden Systemen auch in ihrer eigenen Funktion eingeschränkt werden. Die Frage, ob GGA unabhängig über eine direkte Interaktion mit Ubiquitin eine Funktion für die Autophagie hat, kann jetzt überprüft werden. Die GGA-KD-FIiege kann auch eingesetzt werden, um in Rescue-Experimenten mit den drei verschiedenen humanen GGAs deren spezifische Funktionen zu untersuchen. Dies war wegen der in Säugetieren vorhandenen Redundanz bisher nicht möglich. 3. Langzeitgedächtnis (LTM) in Drosophila melanogaster - Identifikation der Interaktionspartner für das CER-Protein: Der crammer-Fliegenmutante fehlt das CER-Protein, was mit einem Verlust des Langzeitgedächmisses einhergeht. CER kann die humane Cysteinprotease Cathepsin L hemmen, seine mRNA-Menge nimmt bei LTM-Konditionierung von Drosophila ab. Daraus ist die Hypothese abgeleitet, dass LTM über eine Regulation der Cysteinprotease-Aktivität erfolgen könnte. Wir konnten zeigen, dass die die rekombinanten Drosophila-Cathepsine L und Bl Interaktionspartner von CER in Drosophila sind. Die Interaktion mit Cathepsin Bl erfolgt bei neutralem pH-, die mit Cathepsin L bei saurem pH-Wert. Die Prozessierungsmuster der Proteasen sowie biochemische Konstanten der Enzyme wurden ermittelt. Nach Ergebnissen aus Mutantenanalysen scheint für die Interaktion von CER und Cysteinproteasen der C-Terminus des CER-Proteins erforderlich zu sein. 4. Die saure ß-Galaktosidase von Drosophila: Die saure ß-Galaktosidase (CG3132) wurde identifiziert, das Enzym hat ein pH-Optimum von 4.0. Nach Analysen von Fliegen, in denen die saure ß-Galaktosidase durch RNAi (UAST-System) ausgeschaltet worden war, konnten wir zeigen, dass das Enzym die ß-Galaktosidase-Aktivitat im Gehirn von Drosophila repräsentiert. Eine zweite ß-Galaktosidase (CG9092) weist ein pH-Optimum von pH 5.5 auf, ist im Golgi-Apparat lokalisiert und zeigt ein anderes Expressionsmuster. Dieses Enzym wird bei den üblichen Nachweisen von Genen mit bakterieller ß-Galaktosidase im X-Gal-Test erfasst. Mit diesen, im Verlauf des Projekts erhaltenen Ergebnissen, Knockdown-Fliegen und Materialien ist die Grundlage geschaffen für gezielte, detaillierte Untersuchungen zur Rolle der Lysosomen in der neuronalen Entwicklung.
