Kinetisches Tieftemperatur-Fourier-Transform-Infrarot-Spektrometer
Final Report Abstract
Die Infrarotspektroskopie ermöglicht es, funktionsrelevante Strukturaspekte von Biomolekülen (e.g., Protonierungen, Bindung von Kofaktoren und Liganden, Isomerisierungen) und deren zeitliche Veränderungen hochspezifisch und präzise zu verfolgen. In unserem Institut wird die Infrarotspektroskopie in drei verschiedenen Arbeitsbereichen eingesetzt, die im Folgenden kurz skizziert werden. Die Arbeitsgruppe Nienhaus untersucht seit vielen Jahren die Ligandenbindung an Hämproteinen. In den letzten Jahren haben wir uns insbesondere mit Hämenzymen (Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO), Stickoxidsynthase (NOS)) befasst und hier die Interaktion zwischen Protein, Ligand und Substrat über weite Temperaturbereiche analysiert, um Einblicke in die molekularen Details der enzymatischen Reaktion zu erhalten. Wir verwenden Kohlenmonoxid (CO) als infrarotaktive Sonde anstelle des physiologischen Sauerstoffliganden (O2). Die genaue Frequenz der CO-Streckschwingung wird durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen dem CO-Dipol und seiner Umgebung bestimmt, so dass der Ligand als sehr empfindliche intramolekulare Sonde verwendet werden kann. Dadurch konnten wir die Binding des Substrats im aktiven Zentrum in unmittelbarer Nähe zum CO direkt nachweisen. Die Variation der CO-Streckfrequenz gab dabei Hinweise auf mögliche Orientierungen des Substrats. Durch Photolyse mit einem 532-nm Laser und Beobachtung der anschließenden Rückbindung über einen weiten Temperaturbereich (3 – 300 K) wurden neue Einblicke in Ligand- und Substratdynamik gewonnen. Fluoreszente Proteine (FPs) spielen als Markerproteine in der Fluoreszenzmikroskopie eine bedeutende Rolle. Insbesondere die photoschaltbaren FPs (psFPs) haben entscheidend dazu beigetragen, die Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Zellen mit Höchstauflösung voranzutreiben. Das reversible, lichtinduzierte „An- und Ausschalten“ der Fluoreszenz wird dabei durch eine reversible Isomerisierung zwischen den cis- und trans-Konformationen des Chromophors erzielt. Beide Konformationen zeigen charakteristische Absorptionsbanden im infraroten Spektralbereich und können dadurch identifiziert werden. Wir benutzen die Chromophorbanden (1000 – 1800 cm^-1) außerdem, um die Relaxation des Systems nach einer lichtgetriebenen Isomerisierung kinetisch zu verfolgen. Dabei werden Temperatur und Aktivierungswellenlänge variiert. Außerdem bringen wir gezielt Punktmutationen ein, um das Zusammenspiel zwischen Chromophor und Proteinumgebung besser zu verstehen mit dem Ziel, die optischen Eigenschaften der FPs weiter zu verbessern. Nanopartikel sind aus unserem Alltag nicht mehr wegzudenken. In biologischen Medien (z. B. Blut, Lungenflüssigkeit) werden sie sofort von einer Proteinadsorptionsschicht (Proteinkorona) eingeschlossen, die die eigentlichen physikochemischen Eigenschaften der Partikel maskiert und stattdessen die Interaktion der Nanopartikel mit Biomaterialen wie z. B. Zellen bestimmt. In medizinischen Anwendungen ist man u.a. bestrebt, die Partikel als Nanodrug-Vehikel zu verwenden. Hier gilt es, mögliche Strukturänderungen bis hin zur Denaturierung der „medizinisch wirksamen Komponente“ zu erkennen und, wenn nötig, durch eine geeignete Strukturierung der Partikeloberfläche zu vermeiden. Wir setzen die Infrarotspektroskopie ein, um anhand der Amidbanden mögliche Strukturänderungen aufzuzeigen. Form und Lage (Streckfrequenz) der Amidbanden geben Hinweise auf die Sekundärstruktur, so dass Änderungen in den relativen Anteilen von α-Helices, β-Faltblättern oder Knäuel (random coil) aufgrund der Adsorption der Proteine an die Partikeloberfläche erkannt werden können.
Publications
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Ligand Dynamics in Heme Proteins Observed by Fourier Transform Infrared-Temperature Derivative Spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 1814 (2011) 1030-1041
Nienhaus, K., & Nienhaus, G. U.
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Ligand Migration in Human Indoleamine-2,3 Dioxygenase. IUBMB Life 63 (2011) 153-159
Nienhaus, K., Nickel, E., Lu, C., Yeh, S.-R., & Nienhaus, G. U.
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Ligand Binding to Heme Proteins: A Comparison of Cytochrome c Variants with Globins. J. Phys. Chem. B 116 (2012) 12180-12188
Nienhaus, K., Zosel, F., & Nienhaus, G. U.
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Temperature Dependence of the Heat Diffusivity of Proteins. J. Chem. Phys. A 116 (2012) 2620-2628
Helbing, J., Devereux, M., Nienhaus, K., Nienhaus, G.U., Hamm, P., & Meuwly, M.
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An Engineered Heme-Copper Center in Myoglobin: CO Migration and Binding. Biochim. Biophys. Acta 1834 (2013) 1824-1831
Nienhaus, K., Olson, J. S., & Nienhaus, G. U.
