Hochauflösendes Ionenfallen Massenspektrometer mit HPLC
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Unterschiedliche Forschungsprojekte beschäftigen sich mit der Identifikation von Zielproteinen kleiner bioaktiver Moleküle in Bakterien und humanen Zellen. Um die Selektivität von Molekülen für Proteinklassen bzw. für einzelne Proteine zu bestimmen, wird die Strategie des Aktivitätsbasierenden Protein Profiling (ABPP) angewendet. Unterschiedliche Zell- bzw. Bakterienpopulationen können optisch an Hand des individuellen Labelingmusters mit Sonden auf Fluoreszenzgelen verglichen werden und sich abhebende Proteinbanden ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Die erfolgreiche Anwendung dieser Methode wird beispielhaft an Hand der folgenden Projekte aufgezeigt. Der von der Pflanze Ctyptocarya rugulosa stammende Naturstoff Rugulacton wurde hinsichtlich seiner antibiotischen Aktivität in pathogenen Bakterien getestet. Durch die Synthese von vier auf Rugulacton basierenden Strukturen konnte eine Keton-Michael-Akzeptor Gruppe im Vergleich zum Naturstoff und weiteren davon abgeleiteten Substanzen als reaktivste und somit für die antibakterielle Wirkung ausschlaggebende Verbindung identifiziert werden. Das inhibierte Zielprotein 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine phosphat kinase (ThiD) ist essentiell für die Thiaminbiosynthese in Bakterien und stellt zusammen mit weiteren Zielproteinen Angriffspunkte insbesondere für die Inhibition von Listeria monocytogenes dar. Die von dem Naturstoff Xanthatin abgeleitete Verbindung a-alkyliden-y-butyrolakton sowie einige Derivate wurden hinsichtlich Ihrer Reaktivität und Selektivität gegenüber Zielproteinen in E. coli untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Reaktion mit Cysteinen im aktiven Zentrum von Zielproteinen auf eine a-Methylen-Michael-Akzeptor Gruppe zurückzuführen ist. Dementsprechend zeigten Verbindungen in welchen die a-Methylen-Michael-Akzeptor Gruppe substituiert wurde keine Reaktivität mehr gegenüber den detektierten Zielstrukturen. Des Weiteren gelang mit a-alkyliden-y-butyrolakton ein differenzielles Labeling von nicht pathogenen und pathogenen E. coli Stämmen. So wurde das Protein c2450 selektiv den uropathogenen Stämmen 536, CFT073 und UTI89 markiert. Interessanterweise zählt c2450 zu den bislang wenig charakterisierten Proteinen, spielt aber auf Grund seiner Kodierung im genomischen Cluster einer nicht-ribosomalen Peptidsynthetase eine Rolle bei der Herstellung des bakteriellen Toxins Colibactin. Zusätzlich zur Untersuchung bakterieller Inhibitoren wird die Methode des Aktivitätsbasierten Protein Profiling für potentielle Krebstherapeutika angewendet. Abgeleitet von dem cytostatischen Tetrapeptid Prätubulysin wurden Sonden hergestellt, die nicht nur die Bindung der bekannten Zielstruktur ß-Tubulin bestätigen, sondern auch die hohe Selektivität dieser Interaktion und die Unterdrückung ungewünschter Bindungspartner aufzeigen. Die Reaktion der Sonde mit ß-Tubulin blockierte den Aufbau von Mikrotubulinstrukturen die maßgeblich am Aufbau der mitotischen Spindel und somit der Zellteilung beteiligt sind. Während die Validierung des Zielproteins über MS erfolgte, konnte die Zerstörung der Mikrotubulistrukturen mit Hilfe unterschiedlicher fluoreszenzgelabelter Sonden erfolgen. Für ein weiteres potentielles Krebstherapeutikum Duocarmycin, welches auf Grund seiner hohen Myelotoxizität nicht klinisch eingesetzt wird, wurden basierend auf der Duocarmycinstruktur Analoga hergestellt. Die inaktiven Duocarmycinderivate können nach Lokalisation an Tumorzellen zielgerichtet aktiviert werden. Zusätzlich zum bekannten Wirkmechanismus von Duocarmycin durch Bindung an doppelsträngige DNA, konnte mittels aktivitätsbasiertem Protein Profiling auch ein spezifisches Protein, Aldehyddehydrogenase 1, als Angriffsziel identifiziert werden. Die Hemmung schnell proliferierender Krebszellen könnte somit durch einen dualen Mechanismus begründet sein, welcher die Bindung an die DNA und die chemische Inhibition des essentiellen Stoffwechselenzyms Aldehyddehydrogenase 1 einschließt. Weitere Projekte behandeln die bakterizide Eigenschaft von HOCI, welches von neutrophilen Immunzellen zur Abwehr von invasiven Bakterien eingesetzt wird. Es konnten oxidative Modifikationen an drei Methioninresten des HypT Proteins, eines hyperchlorite sensitiven Transkriptionsfaktors, lokalisiert und die dadurch bedingte Aktivierung dieses Proteins gezeigt werden. Eine auf diesen Ergebnissen aufbauende Publikation beschreibt die negative Regulation der DNA Bindungsaktivität von HypT durch die Oxidation von Cystein 4 im Falle einer unvollständigen Aktivierung dieses Transkriptionsfaktors. Neben dem bisher genannten Leistungsspektrum dient die hochauflösende Messung mit der Orbitrap XL vor allem auch zur exakten Massebestimmung neu synthetisierter Produkte auf denen zahlreiche Publikationen begründet sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Enantioselective radical cylisation reacbons of 4-substituted quinokenes rnediated by a chiral template. Organic & Biomolecular Chemistry, Vol. 9. 2011, pp. 3516-3529.
Bakowski A. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1039/C0OB01272F) - Synthesis of Catalytically Active Ruthenium Complexes with a Remote Chiral Lactam as Hydrogen-Bonding Motif. Synthesis, Vol. 2011, Issue 6, pp. 961-971.
Voss F et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1055/s-0030-1258424) - Unraveling the protein targets of vancomycin in living S. aureus and E. faecalis cells. Journal of the American Chemical Society, Vol. 133. 2011, Issue 31, pp. 12144–12153.
Eirich J. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1021/ja2039979) - Vibralactone as a Tool to Study the Activity and Structure of the ClpP1P2 Complex from Listeria monocytogenes. Angewandte Chemie International Edition, Vol. 50. 2011, Issue 46, pp. 11001–11004.
Zeiler E. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1002/anie.201104391) - Activity-based probes for studying the activity of flavin-dependent oxidases and for the protein target prohfino of MAO-inhibitors. Angewandte Chemie International Edition, Vol. 51. 2012, Issue 28, pp. 7035–7040.
Krysiak J.M. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1002/anie.201201955) - Antibiotic activity and target discovery of three-membered natura) product-derived heterocycles in pathogenic bacteria. Chemical Science, Vol. 3. 2012 , pp. 2035-2041.
Pitscheider, M. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1039/C2SC20290E) - Rugulactone and its Analogues Exert Antibacterial Effects through Multiple Mechanisms Including Inhibition of Thiamine Biosynthesis. ChemBioChem, Vol. 13. 2012, Issue 10, pp. 1439–1446.
Nodwell M.B et al:
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1002/cbic.201200265) - Stereoselective Preparation of (E)-Configured 1,2-Disubstituted Propenes from Two Aldehydes by a Two-Carbon Stitching Strategy: Convergent Synthesis of 18,21-Diisopropyl-Geldanamycin Hydroquinone and Its C7 Epimer. Chemistry - A European Journal, Vol. 18. 2012, Issue 33 (Special Issue: Conference Issue: 4th European Chemistry Congress, Prague), pp. 10382–10392.
Hampel T. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1002/chem.201201600) - Copper-Assisted Click Reactions for Activity-Based Proteomics: Fine-Tuned Ligands and Refined Conditions Extend the Scope of Application. ChemBioChem, Vol. 14. 2013, Issue 18, pp. 2447–2455.
Rudolf G. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1002/cbic.201300551) - Methionine oxidation actNates a transcription factor in respon. to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 110. 2013, Issue 23, pp. 9493-9498.
Drazic A. et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1073/pnas.1300578110) - Role of cysteines in the stability and DNA-binding activity of the hypochlorite-specific transcription factor HypT. PLoS ONE, Vol. 8,2013, Issue 10: e75683.
Drazic A. et al.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0075683) - Target profiling of 4-hydroxyderricin b S. aureus reveals seryl-tRNA synthetase binding and inhibition by covalent modificaticn
Molecular BioSystems, Vol. 9. 2013, pp. 343-351.
Battenberg O.A. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1039/C2MB25446H) - Disruptian of oligornerizaticn and dehydroalanine formation as rnechanisms for CIpP protease Inhibition. Journal of the American Chemical Society, Vol. 136. 2014, Issue 4, pp. 1360–1366.
Gersch M. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1021/ja4082793) - Omuralide and Vibralactone: Subtle differences in the proteasome β–lactone-γ-lactam binding scaffold alters target preferences. Angewandte Chemie International Edition, Vol. 53. 2014, Issue 2, pp. 571–574.
List A. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1002/anie.201308567) - α-Methylene-y-butyrolactones attenuate Staphylococcus aureus virulence by inhibition of transcriptbnal Regulation. Chemical Science, Vol. 5. 2014, pp. 1158-1167.
Kunzmann M.H. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1039/C3SC52228H) - β-Sultams exhibit discrete binding preferences for diverse bacterial enzymes with nucleophilic residues. Chemical Communications, Vol. 50. 2014, pp. 427-429.
Kolb R. et al.
(Siehe online unter https://dx.doi.org/10.1039/C3CC46002A)
