Herstellung eines humanen L1-Retrotransposons, welches ausschließlich in definierte, sichere Bereiche des humanen Genoms integriert
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Transposons sind genetische Elemente, die in der Lage sind, sich innerhalb eines Genoms zu bewegen. Das menschliche Genom besteht zu etwa 45% aus Transposons oder deren Überresten, wobei das LINE-1 (L1) Element das einzige autonome Transposon ist, welches noch aktiv ist. Vor meinem Stipendium habe ich mich mit dem Integrationsmechanismus des TRE5-A Transposons beschäftigt, welches immer in bestimmte Stellen im Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum integriert, während die allermeisten anderen Transposons nicht zielspezifisch integrieren. Wir konnten zeigen, dass diese spezifische Integration durch eine Proteininteraktion zwischen einem Teil eines Transkriptionsfaktors und einem Protein von TRE5-A vermittelt wird. Auch wenn TRE5-A und LI aus komplett unterschiedlichen Organismen stammen, sind sie von ihrem Aufbau und ihrem Transpositionsmechanismus her sehr ähnlich. Beide Elemente sind ca. 6 kb lang und codieren jeweils für zwei offene Leserahmen. Die Interaktionsdomäne von TRE5-A liegt innerhalb des ersten offenen Leserahmens (ORF1). Das ORF1 Protein bildet bei L1, und höchstwahrscheinlich auch bei TRE5-A, die äußere Struktur des Präintegrationskomplexes, während das ORF2 Protein die für die Retrotransposition notwendigen Enzymdomänen trägt und sich wahrscheinlich im inneren des Komplexes befindet. Im Rahmen meines DFG Stipendiums habe ich versucht, humane L1 Elemente herzustellen, welche über verschiedene Mechanismen nur noch in vorher bestimmbare Regionen des humanen Genoms integrieren. Ein solches Element könnte zum einen hilfreich sein, um die Entwicklung von neuen Gentherapievektoren voran zu treiben, bei denen momentan noch die unspezifische Integration ein großes Problem darstellt. Zum anderen könnte mit einem solchen Element der Integrationsmechanismus von L1 weiter aufgeklärt werden. Dafür habe ich verschiedene Proteindomänen an die L1 Proteine fusioniert, die dem Element eine ZIelspezifität verleihen sollen. Analog zu TRE5-A wollte ich die Domänen zunächst an ORF1 fusionleren, da es logisch erscheint, dass der Integrationskomplex per Interaktion mit ORF1 an die gewünschte Integrationsstelle gebracht werden soll. Zu unserer großen Enttäuschung haben alle Domänen, die ich an L1-ORF1 fusioniert habe, die Retrotranspositionsaktivität des jeweiligen Elementes komplett unterbunden. Das war nicht zu erwarten, da es mehrere Publikationen gibt, in denen verschiedene Domänen an L1-ORF1 fusioniert wurden, ohne die Aktivität des Elementes zu beeinträchtigen. Die Publikationen, In denen größere Domänen an L1-ORF1 fusioniert wurden, stammen aus demselben Labor und es wurden in den jeweiligen Publikationen dazu keine Daten gezeigt, sondern die Ergebnisse nur im Text beschrieben. Wir haben in dem Labor angefragt, die Plasmide der publizierten Elemente zu bekommen und überprüfen die Aktivität dieser Elemente, sobald wir die entsprechenden Plasmide erhalten haben. Ich habe des Weiteren mehrere aktive L1-Elemente hergestellt, welche Fusionen an ORF2 tragen, die diesen Elementen eine Zielspezifität geben sollen. Zur Überprüfung der Zielspezifität dieser Elemente habe ich stabile Zelllinien etabliert, in denen ich diese Elemente mobilisiert habe. Diese werden zurzeit in einer Kollaboration mit dem Labor von Gael Cristofari in Nizza (Frankreich) per FISH und Sequenzierung untersucht. Um mein Projekt abzuschließen und zu publizieren, habe ich eine Anschlussfinanzierung von meinem Gastlabor erhalten.
