Zellkulturfermentationssystem
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Forschungsgroßgeräte wurden am IBVT der Universität Stuttgart für die Ersteinrichtung eines Zellkulturlabors verwendet. Durch ihre Installation gelang die erfolgreiche Inbetriebnahme der Zellkulturaktivitäten unter besonderer Berücksichtigung von industriell genutzten Säugerzellen der CHO (chinese hamster ovary)- Linie. Seit 2011 konnten daher die nachfolgenden Forschungsarbeiten gestartet und erfolgreich weitergeführt werden: 1) systembiologische Untersuchungen von prozesstechnischen Einflussgrößen auf Mitochondrien: In Produktionsprozessen werden u.a. Osmolaritäts-Shifts durchgeführt, um den Zellzyklus zu arretieren, was oft mit der Steigerung zellspezifischer Leistungsdaten einhergeht. Dieses Phänomen wird durch die kombinierte Anwendung von Fluoreszenzmarkierung, Metabolom- und Stoffflussanalyse untersucht. Dabei kommen kommerziell erhältliche, wie auch von einem Firmenpartner zur Verfügung gestellte Antikörperproduzenten zum Einsatz. 2) Organelispezifische Metabolornanalyse in CHO: Unter Verwendung von CHO K1 Stämmen gelang die Entwicklung eines analytischen Ansatzes zur Quantifizierung intrazellulärer Metabolite, getrennt nach cytosolischen und (bevorzugt) mitochondrialen Komponenten. In Verbindung mit separat entwickelten LC-QQQ-MS Methoden konnten so erstmalig Zentralstoffwechselmetabolite sowie Nukleotide während des Prozessverlaufs detektiert werden. 3) Identifizierung und Quantifizierung der intrazellulären Degradation heterologer Antikörper in CHO: In Kombination mit einer LC-Q-ToF Technik (ebenfalls über einen DFG Großgeräteantrag erhalten) gelang (erstmalig) die intrazelluläre Verfolgung von Peptidfragmenten, als Degradationsprodukte heterolog hergestellter Antikörper in CHO Zellen. Aktuell werden 13C-Markierungen durchgeführt, um entsprechende Raten zu quantifizieren. 4) Auswirkung prozesstechnischer Einflussgröllen auf die transkriptionale Regulation: Die Auswirkung von variablen Einflussgrößen des Kultivierungsprozesses auf z.B. die transkriptionale Regulation von CHO Zellen wird in prozesstechnisch definierten 2L Bioreaktoren untersucht. Entsprechende Arbeiten laufen noch. 5) Manahmen zur Prozessintensivierung mit Antikörper produzierenden CHO: In der biopharmazeutischen Industrie ist die Intensivierung der Produktionsprozesse von besonderer Bedeutung. Damit einhergehend wird häufig ein Leistungsabfall der Produzenten beobachtet. Mit Hilfe von Werkzeugen wie z.B. der metabolischen Stoffflussanalyse oder metabolic fingerprinting wird daher nach entsprechenden Ursachen gesucht, um Vorschläge zur Vermeidung von Leistungseinbußen zu formulieren. 6) Modellgestützte Anlagenauslegung zur Optimierung des Stofftransportes: Biopharmazeutische Reaktoren unterliegen dem dualen Problem, bei relativ geringen Leistungseinträgen einerseits einen hohen Sauerstoffeintrag und andererseits eine äquivalent hohen CO2-Austrag zu erreichen. Letzterer ist notwendig, um inhibierende Gelöst-0O2-Werte zu vermeiden. Daher werden am IBVT computational fluid dynamic Simulationen zur Anlagenauslegung durchgeführt, die durch experimentelle Messungen unterlegt werden. Für letzteres werden u.a. die Bioreaktoren der Zellkultur eingesetzt, um z.B. Henry-Konstanten der Gaslöslichkeiten unter den gegebenen experimentellen Bedingungen zu bestimmen und entsprechende kLa Werte zu ermitteln.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Host Organisms Mammalian Cells. Industrial Biotechnology, Wiley-VCH, Eds: Wittmann & Liao
J. Pfizenmaier und R. Takors
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2015. Changes in Intracellular ATP-Content of CHO Cells as Response to Hyperosmolality. Biotechnology Progress (5) 1212-1216
Pfizenmaier, J., Matuszczyk J.-C., Takors R.
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2015. Compartment-specific metabolomics for CHO reveals that ATP pools in mitochondria are much lower than in cytosol. Biotechnology Journal. 10(10) 1639-1650
Matuszczyk J.-C., Teleki, A., Pfizenmaier, J., Takors R.
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2015. Monitoring Intracellular Protein Degradation in Antibody Producing Chinese Hamster Ovary Cells. Engineering in Life Science. 15 (5), 499-508, July 2015
Rimbon J., Sanchez-Kopper A., Takors R.
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Hyperosmotic Stimulus Study Discloses
Benefits in ATP Supply and Reveals miRNA/mRNA Targets to Improve Recombinant Protein Production of CHO Cells. Biotechnology Journal, 2016, 11, Issue 8, 1037-1047
Pfizenmaier J., Junghans L., Teleki A., Takors R.
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Predictability of kLa in stirred tank reactors under multiple operating conditions using an Euler–Lagrange approach. Engineering in Life Sciences, Vol 16, Issue 7, Special Issue: Scale‐Up – Scale‐Down, October 2016, Pages 633-642
Wutz, J., Lapin, A., Siebler, F., Jan Erik Schäfer, Thomas Wucherpfennig, Martina Berger, Takors, R.
