Untersuchungen zur Struktur, Dynamik und Funktion spinmarkierter durch Dimerisierung aktivierter G-Proteine mittels Multifrequenz CW- und Puls-EPR

• Antragsteller: Dr. Johann P. Klare
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 175245785

Auch wenn in den vergangenen Jahren Strukturinformationen für verschiedene Domänen von Roco-Proteinen aus Röntgenkristallstrukturanalysen gewonnen werden konnten, existieren zum Zeitpunkt der Antragsstellung praktisch keine Informationen über die Tertiärstrukturen dieser Proteine, d.h. die relative Anordnung dieser Domänen in der aktiven Form des vollständigen Proteins. Weiterhin liegen strukturelle Daten für bakterielle Roco-Proteine bislang nur in nukleotidfreier oder GDP-gebundener Form vor, wodurch Aussagen über die der GTP-Hydrolyse zugrundeliegenden Mechanismen weiterhin nur eingeschränkt möglich sind. Für Roco-Proteine, die über eine zusätzliche Kinase-Domäne verfügen, wie beispielsweise Dyctostelium Roco4 oder das humane LRRK2, wurde gezeigt, daß sich GTPase- und Kinase-Aktivitäten gegenseitig beeinflussen . Dieser Aspekt ist im Hinblick auf die Auswirkungen von Mutationen in LRRK2 von besonderem Interesse, da die meisten Daten darauf hindeuten, daß eine erhöhte Kinase-Aktivität der auslösende Faktor für eine Parkinson-Erkrankung ist. Da auch Mutationen in der Kinase oder anderen LRRK2-Domänen zu erhöhten Kinase-Aktivitäten und damit zu PD führen können, stellt sich bei Mutationen in der RocCOR-Domäne die Frage, wie diese am Ende zu einer Aktivierung der Kinase führen, d.h. welche strukturellen oder dynamischen Änderungen dieses Signal innerhalb des Proteins weiterleiten. Aktuelle Forschungsergebnisse liefern weiterhin Hinweise darauf, daß LRRK2 im Cytosol als (inaktives) Monomer vorliegt und das Membran-Assoziation zur Bildung von (aktiven) Dimeren führt . Weitere Hinweise auf ein Konzentrations- und Nukleotidabhängiges (GppNHp induziert die Monomerisierung bei geringen, physiologisch relevanten Konzentrationen) Monomer-Dimer-Gleichgewicht existieren auch für Chlorobium tepidium Roco, wohingegen das analoge Protein aus Methanosarcina barkeri diesen Verhalten nicht aufzuweisen scheint . In einem vergleichenden Ansatz soll dieses potentielle Monomer-Dimer-Gleichgewicht näher, d.h. auch im Hinblick auf strukturelle Auswirkungen, untersucht werden. Aufbauend auf den in der ersten Förderperiode erzielten Resultaten und den mit dem System gewonnenen Erfahrungen sollen mittels EPR-Spektroskopie (cw- und Puls/DEER) und Computersimulationen folgende Aspekte untersucht werden: 1. Bestimmung der Tertiärstruktur und Dynamik von LRR-RocCOR-Konstrukten während des GTPase-Zyklus mittels DEER-Abstandsmessungen 2. Untersuchung des Monomer-Dimer-Gleichgewichte bei Roco-Proteinen mittels cw- und Puls-EPR-Methoden 3. Erstellung von Homologie-Modellen der entsprechenden LRRK2-Domänen, basierend auf Kristallstrukturen der Domänen bakterieller Roco-Proteine 4. Vergleich der experimentell bestimmten Konformationsdynamik bakterieller RocCOR- und LRR-RocCOR-Konstrukte über Molekulardynamik-Simulationen mit vorhandenen Strukturdaten und LRRK2- Homologie-Modellen

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen