Mechanismen der durch dentale Monomere induzierten Apoptose
Final Report Abstract
Eukaryotische Zellen produzieren nach Exposition gegen Monomere dentaler Komposite wie HEMA (2-Hydroxyethylmethacrylat) sehr rasch eine erhöhte Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und damit oxidativen Stress. Ziel des Projektes war zum einen die Identifizierung von ROS und die Quelle ihrer Bildung in Anwesenheit von HEMA. Zum anderen sollten mit der Charakterisierung des Nrf2-Systems molekulare Mechanismen der zellulären Redoxregulation in HEMA-exponierten Zellkulturen analysiert werden. Drei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe (DCFH2-DA, DHE, (DHR123) zeigten die differenzielle Entwicklung verschiedener Arten von ROS in HEMA-exponierten Zellen abhängig von der Dauer der Exposition. Während HEMA nach kurzen Expositionszeiten allgemein oxidativen Stress erzeugt (DCF-Fluoreszenz), dessen Natur bisher nicht näher bekannt ist, steigt nach einer langen Expositionsdauer vor allem die Menge an Wasserstoffperoxid (H2O2). Das Maß der Produktion von oxidativem Stress und H2O2 war auch von der Verfügbarkeit von Glutathion, dem zentralen nichtenzymatischen Antioxidans, abhängig. Tempol, ein Radikalfänger für Superoxidanionen schützt Zellen vor der HEMA-induzierten Apoptose ebenso wie Natriumformiat (NaFM), ein bekannter Radikalfänger für Hydroxylradikale. Aufbauend auf diese Daten wurde die Expression des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2/Keap1 analysiert. Nrf2 ist ein zentraler Regulator der zellulären Redoxhomöostase, weil er die Expression von Proteinen steuert, die reaktive Sauerstoffspezies bilden, metabolisieren und so oxidativen Stress abbauen, oder Reduktionsäquivalente (Elektronen) in Form von NADPH für diesen Metabolismus liefern. Die Expression von Nrf2 steigt in Zellkernen bereits nach relativ kurzer Exposition der Zellen gegen HEMA sehr stark. In den mit HEMA behandelten Kulturen ist die Expression des Stressproteins Hämoxygenase (HO-1), ein direktes Zielgen von Nrf2, stark erhöht. Unsere Analysen zeigen außerdem, dass die aktivierte Expression von Nrf2 sowie diejenige der Nrf2-regulierten enzymatischen Antioxidantien, des Glutathion-Pathways und des NADPH- regenerierenden Systems (Pentosephosphatweg), eine sehr schnelle, protektive und adaptive Zellantwort gegen HEMA-induzierten oxidativen Stress ist. Die Stimulierung der Expression von Nrf2 etwa durch eine elektrophile Substanz wie tBHQ (tert-Butylhydroquinon) reduziert oxidativen Stress und schützte Zellen gegen HEMA-induzierte Apoptose. ROS werden unter physiologischen Bedingungen in verschiedenen Zellkompartimenten auf ganz unterschiedliche Weisen gebildet. Im vorliegenden Projekt sollte in erster Präferenz die Wirkung dentaler Monomere auf die Aktivität von NADPH-Oxidasen, die mit NADPH als Elektronendonor direkt Superoxidanionen erzeugen, analysiert werden. Für das Verständnis Monomer-induzierter adaptiver Zellreaktionen sehr wichtige Ergebnisse wurden zunächst mit Diphenyliodonium (DPI) erzielt. DPI ist ein unspezifischer Inhibitor der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch Flavoenzyme, zu denen neben NADPH-Oxidasen (Nox) auch die Quinon-Oxidoreduktase (Komplex I), Cytochrom-P450-Reduktasen sowie die Stickstoffmonoxid-Synthasen (nitric oxide synthase, NOS) zählen. NOS erzeugen mit NO (Stickstoffmonoxid) ein wichtiges Signalmolekül für die Regulation physiologischer Funktionen. DPI inhibiert hier konzentrationsabhängig die HEMA-induzierte Apoptose. Die Wirkung von DPI in HEMA- exponierten Zellkulturen wurde auch hinsichtlich der Expression von Enzymen wie Nox2 und NOS analysiert, Enzyme, die auch der Regulation der Redoxhomöostase dienen. Dramatisch wirkt hier HEMA alleine, denn die starke Expression von NOS in unbehandelten Zellkulturen ist in Anwesenheit des Monomers vollkommen inhibiert. Gerade dieses Ergebnis ist ein sehr starker Hinweis auf die Bedeutung von NO für adaptive Reaktionen in HEMA-exponierten Zellen. Die HEMA-induzierte Expression von Nrf2 als auch diejenige von HO-1 wird durch DPI konzentrationsabhängig reduziert. Dies verweist auf deutlich reduzierten oxidativen Stress in Anwesenheit von DPI wahrscheinlich aufgrund der Inhibition von Nox2 (p47phox) und NOS. Daher darf man annehmen, dass in HEMA-exponierten Zellen Superoxidanionen mit Stickstoffmonoxid (NO) reagieren und so Peroxynitrit (ONOO-) bilden. Dieses neue hypothetische Modell adaptiver Mechanismen in HEMA-exponierten Zellen mit ONOO- als wirksamem Agens wird durch die Analysen mit Apocynin, ein Inhibitor von Nox2, unterstützt. Apocynin inhibiert konzentrationsabhängig die Induktion von Apoptose durch HEMA. Dieses Resultat lässt vermuten, dass Nox2 und damit die Produktion von Superoxidanionen für die Monomer-induzierten Apoptose relevant sind. XOR (Xantin-Oxidoreduktase) ist für HEMA-induziertem oxidativen Stress und Apoptose ohne Bedeutung. Experimente mit VAS2870, ein weiterer Inhibitor von NADPH-Oxidasen, ergeben keine zusätzliche Information. Die Verwendung von L-NAME, ein Inhibitor von NOS, zeigt aber, dass NO für HEMA-induzierten oxidativen Stress wichtig sind, jedoch keinen Einfluss auf die HEMA-induzierte Apoptose haben. Die Ergebnisse dieses Projektes insgesamt sind neu und originell und ein wirklicher Fortschritt in der Charakterisierung des Monomer-induzierten oxidativen Stress. Wie schon die Charakterisierung der Funktion von Nrf2, verbinden auch die Analysen des Ursprungs des Monomer-induzierten oxidativen Stress Grundlagenforschung mit klinischer Relevanz. Die Verwendung pharmakologischer Inhibitoren auf Dentin in pulpanahen Arealen tiefer Kavitäten könnte neben der potentiellen Stimulation der Expression von Nrf2 eine alternative therapeutische Option werden. Die Inhibition der Quellen von ROS/RNS würde Monomer-erzeugten oxidativen Stress senken und so Funktionen des Pulpagewebes unterstützen (vgl.: http://www.dgzmk.de/uploads/tx_szdgzmkdocuments/Pulpaschutz_unter_ Komposit-Restaurationen.pdf9).
Publications
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Activation of the Nrf2-regulated antioxidant cell response inhibits HEMA-induced oxidative stress and supports cell viability. Biomaterials 2015;56:114-28
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Cell responses to cariogenic microorganisms and dental resin materials-Crosstalk at the dentin-pulp interface? Dent Mater 2017 Mar 7. pii: S0109-5641(16)30662-5
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Flavin-containing enzymes as a source of reactive oxygen species in HEMA-induced apoptosis. Dent Mater 2017 Feb 18. pii: S0109-5641(16)30449-3
Schweikl H, Gallorini M, Forstner M, Petzel C, Bolay C, Hiller KA, Cataldi A, Krifka S, Buchalla W
