Mikroskopsystem mit Multiphotonenanregung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das 2-Fotonen-Laser-Scanning Mikroskop wurde in den ersten drei Jahren im wesentlichen in den folgenden zwei wissenschaftlichen Schwerpunkten der Arbeitsgruppe eingesetzt: A) Neuronen-Glia Interaktionen. Bestimmung der Motilität von kleineren Fortsätzen von NG2-Gliazellen. NG2-Gliazellen sind Vorläuferzellen von Oligodendrozyten und kommen in großer Zahl im unreifen und reifen Gehirn vor. Diese Zellen gehen mit ihrem komplexen Fortsatzbaum morphologische Interaktionen mit benachbarten Axonen ein, welche zur Ausbildung von klassischen synaptischen Strukturen führen. Auf diese Weise erhalten NG2 Zellen synaptischen Eingang von benachbarten Neuronen. Wir haben das geförderte Gerät eingesetzt, um die Beweglichkeit derjenigen kleinen Fortsätze zu testen, welche Synapsen empfangen. Hierbei war die Ausrüstung mit einem schnellen resonanten Scanner und mit einer schnellen Piezo-gesteuerten Fokuseinheit von besonderem Vorteil Um hohe Raten von Bildstapeln aufnehmen zu können. Wir konnten zeigen, dass der Fortsatzbaum von NG2 Zellen ausgesprochen dynamisch und plastisch ist und sich im sub- Minuten Bereich nahezu „runderneuern“ kann. Wir interpretieren diese hohe Dynamik dahingehend, dass sie NG2 Zellen in die Lage versetzt rasch präsynaptische Transmitterfreisetzungsstellen aufzuspüren. Weiterhin haben wir das Gerät eingesetzt um zu prüfen ob intrazelluläre Calciumssignale an der Integration von synaptischen Eingängen in NG2 Zellen beteiligt sind. In der Tat konnten wir synaptische-stimulierte Calciumssignale in NG2 Zellen sowohl durch Kalzium-Indikatoren (Fluo-4) wie auch durch genetisch codierte Kalzium-Sensoren (GCamp5) nachweisen. B) Calcium Signalgebung und Konnektivität von hippokampalen Interneuronen. Hier setzten wir das Gerät an hippokampalen Hirnschnitten ein und messen und quantifizieren Calcium-Signale auf der Basis von Calcium-Indikatoren in großen und kleinen Fortsätzen von Interneuronen. Die hohe Lichtempfindlichkeit des Geräts sowie der geringe Vergrößerungsfaktor des Objektivs (25 fach) erlaubten hierbei ein effektives und komfortables Arbeiten. Wir bestimmten die Calciumspufferkapazität von Parvalbumin-positiven und negativen so genannten Basketzellen und von OLM Interneurone. Schließlich etablierten wir eine Methode um glutamaterge Synapsen auf dem Dendritenbaum von Interneuronen zu lokalisieren und visualisieren. Hierzu exprimieren wir spezifisch in hippokampalen Interneurone einen genetisch kodierten Glutamat-Sensor (IGluSnFr). Nach elektrischer Stimulation von präsynaptischen Pyramidenzellen nutzen wir den schnellen Piezo-Focus und die hohen Bildraten um die elektrisch bestätigten synaptischen Eingänge auf den Dendriten zu lokalisieren. Auf diese Weise mappen wir welche Dendritenbäume und dortige Segmente präsynaptische Pyramidenzellen zur Synapsenbildung bevorzugen.
