Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung neuer Moleküle unter spezifischer Stimulation der Membranrezeptoren der "Toll-like" Familie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Membranrezeptoren der Toll-like-Familie spielen eine zentrale Rolle in der Aktivierung des innaten Immunsystems und Toll-like Rezeptoren (TLRs) erkennen hierbei spezifisch strukturell konservierte mikrobielle Bestandteile. Ihr Engagement führt in Zellen des innaten Immunsystems zur Produktion und Sekretion u.a. von pro-inflammatorischen Zytokinen. Die Induktion dieser inflammatorischen Antworten verläuft über die Aktivierung eines evolutionär konservierten Signaltransduktionsweges, welcher die Moleküle MyD88 und TRAF6 einschließt und Parallelen zum IL-1 induzierten Signaltransduktionsweg zeigt. Die bisherige Datenlage zeigte, dass die Signaltransduktionswege `downstream´ von MyD88 für verschiedene Stimuli nicht absolut kongruent sind. Die Mechanismen Abschlussbericht für DFG Projekt AH 176/1-1 10 der Rezeptoraktivierung selbst, wie auch weitere, offensichtlich notwendige Moleküle dieses Signalweges sind bislang nicht oder nur teilweise definiert. Mittels massenspektrometrischen Methoden in Kombination mit Affinitätschromatographie und Immunpräzipitation sollten in dem vorliegenden Projekt Unterschiede in der Signaltransduktion von TLRs detektiert und neue Interaktionspartner im Signaltransduktionsweg nachgewiesen werden. Als erster Kandidat wurde TRAF3IP3 im Signalproteinkomplex von TLR2 in HEK293-Zellen identifiziert und folglich funktionell charakterisiert. In Fluoreszenzfärbungen konnte keine Rekrutierung unter TLR- Stimulation festgestellt werden. Nach Reportergenanalysen der Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP- 1 sowie nach Untersuchungen des Einflusses von TRAF3IP3 auf die Aktivierung der MAP-Kinase JNK konnte keine Funktion von TRAF3IP3 im TLR-Signaltransduktionsweg festgehalten werden. Als neues wichtiges regulatorisches Protein in der TLR-Signaltransduktion wurde 14-3-3 im Komplex mit TLR2 und MyD88 in separaten Experimenten massnespektrometriach nachgewiesen. In den anschließenden funktionellen Untersuchungen konnte mit Hilfe von mutierten Versionen und Inhibitoren von 14-3-3 in Reporterassays seine unterschiedlichen regulatorischen Effekte auf verschiedene TLRs beobachtet werden. So zeigte sich u.a., dass 14-3-3 theta die TLR2-aktivierte NF-κB- Aktivität hemmt, allerdings unter TLR4-Stimulation die Reporteraktivität erhöht wird. Ein differenzieller Effekt von 14-3-3 konnte ebenfalls in der TLR-induzierten Sekretion von Zytokinen und Chemokinen wie TNFα, IL-6, IP-10, RANTES und IL-8 verdeutlicht werden. Die genaue Rolle von 14-3-3 theta, aber auch 14-3-3 epsilon, in den Signaltransduktionswegen der anderen Toll-like Rezeptoren bedarf zur umfassenden Aufklärung weiterer Untersuchungen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- 2011. Identification and functional characterization of 14-3-3 in TLR2 signaling. Journal of Proteome Research. 2011 Oct 7;10(10):4661-70
Tobias B. Schuster, Victor Costina, Peter Findeisen, Michael Neumaier, Parviz Ahmad-Nejad
