36Derivation and characterization of pluripotent porcine cells(Ableitung und Charakterisierung pluriopotenter Zellen beim Schwein)

• Antragsteller: Professor Dr. Heiner Niemann
• Fachliche Zuordnung: Tierzucht, Tierernährung, Tierhaltung ; Reproduktionsmedizin, Urologie
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 182501798

In den letzten Jahren hat es zwar erhebliche Fortschritte in der Ableitung porziner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) aus somatischen Zellen gegeben. Dennoch konnten echte keimbahngängige pluripotente iPSCs bisher nicht abgeleitet werden. Aus unbekannten Gründen wurden bei allen Zelllinien, über die bisher in der Literatur berichtet wurden, die exogenen Reprogrammierungsfaktoren nicht abgeschaltet, was ein deutlicher Hinweis dafür ist, dass diese Zellen nicht vollständig reprogrammiert sind. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass die Zellkulturbedingungen, die zwischen den verschiedenen Publikationen erheblich variieren, nicht für die Kultur porziner pluripotenter Zellen geeignet sind. Die fortgesetzte Expression der exogenen Transgene in diesen Zellen kann Effekte von Wachstumsfaktoren und/oder Zytokinen im Kulturmedium maskieren oder so verändern, dass eine Optimierung der Kulturbedingungen nicht möglich ist. Bis zum heutigen Tage sind mit einer Ausnahme alle porzinen iPSC von fetalen Fibroblasten abgeleitet worden; ihr Pluripotenzstatus ist jedoch nicht eindeutig nachgewiesen worden (iPSC-ähnliche Zellen). Nur eine Arbeitsgruppe hat keimbahnkompetente Zellen durch Chimärenproduktion nachgewiesen; die Ausgangszellen stammten aber von mesenchymalen Stammzellen (MSC). Dieser Befund zeigt an, dass auch der epigenetische Hintergrund der Ausgangszellen eine wichtige Rolle beim Reprogrammierungsprozess spielen kann. In der nun ablaufenden Förderperiode haben wir Vektoren basierend auf dem Sleeping Beauty Transposon System entwickelt, die die porzinen Transkriptionsfaktoren enthalten und haben diese eingesetzt, um iPSCs von Mausfibroblasten zu erstellen. Wir haben ferner diese Vektoren eingesetzt, um porzine iPSC-ähnliche Zellen zu erstellen, die morphologisch embryonalen Stammzellen bzw. iPSC von der Maus ähneln und die meisten molekularen Marker für Pluripotenz exprimieren. Bei diesen Zellen konnten wir bisher noch nicht das volle Differenzierungspotential pluripotenter Stammzellen nachweisen. In dem neuen Arbeitsprogramm beabsichtigen wir, porzine induzierte pluripotente Stammzellen zu erstellen, die frei von den exogenen Transgenen sind, in dem die Vektoren durch geeignete molekulare Methoden (Cre-Rekombinase) herausgeschnitten werden und die nachfolgende Verwendung dieser Zellen in Versuchen zur Optimierung der Kulturbedingungen. Für diesen Zweck werden wir eine kürzlich publizierte Library mit kleinen Molekülen, die spezifisch für die Stammzellforschung entwickelt sind, verwenden (enthält 46 verschiedene Faktoren). Zusätzlich werden wir verschiedene Zelltypen als Ausgangsmaterial im Reprogrammierungsprozess einsetzen, um die Bedeutung des epigenetischen Hintergrundes im iPSC Produktionsprozess zu evaluieren. Nach Optimierung der Kulturbedingungen ist es unser Ziel, echte keimbahngängige porzine iPSC Zellen abzuleiten und ihre Pluripotenz durch die Produktion von keimbahngängigen Chimären zu demonstrieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen