Strukturelle und funktionelle Analysen zum humanen LMBD1-Mangel und Aufklärung der molekularen Ursache einer neuen Cbl-Komplementationsgruppe

• Antragsteller: Professor Dr. Frank Rutsch
• Fachliche Zuordnung: Kinder- und Jugendmedizin
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 182906966

Ein intakter Vitamin B12 (Cobalamin)-Stoffwechsel ist für das den humanen Organismus essentiell. Nach endozytotischer Aufnahme und vor Umwandlung in die beiden aktiven Coenzyme Methylcobalamin und Adenosylcobalamin in der Zelle wird Cobalamin (Cbl) durch Lysosomen transportiert. Bei den seltenen angeborenen Störungen cblF und cblJ im Cbl-Metabolismus reichert sich freies Cbl in Lysosomen an und die Coenzymsynthese ist gestört. Wir konnten in eigenen Vorarbeiten Mutationen im LMBRD1-Gen als Ursache für den cblF-Defekt nachweisen. Im Rahmen des aktuellen DFG-Projekts konnten wir zeigen, dass die Mutationen zu einem Verlust der LMBD1-Proteinexpression führen. Außerdem konnten wir Mutationen in ABCD4 als Ursache für den cblJ-Defekt nachweisen. Da weder ABCD4 noch LMBD1 eine Transportaktivität für Cbl in vitro aufweisen und beide Proteine nicht interagieren, vermuten wir die Existenz mindestens eines weiteren lysosomalen Adapterproteins, das den lysosomalen Cbl-Transport vermittelt. Wir möchten nun in der Verlängerungsphase des aktuellen Projekts dieses Adapterprotein identifizieren und dessen Bedeutung für den lysosomalen Cbl-Tranport funktionell nachweisen. Zur Identifikation möglicher Interaktionspartner werden wir Immunopräzipitationsexperimente mit an Protein A und Protein G-gekoppelten LMBD1 bzw. ABCD4-Antikörpern und Pulldown-Experimente durchführen. Die präzipitierten Proteine werden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Bei fehlendem Nachweis von direkten Interaktionspartnern werden wir durch eine vergleichende Proteomanalytik von Patientenzellen und Kontrollfibroblasten mögliche Stimulatoren des Cbl-Transports identifizieren. Die funktionelle Bedeutung der identifizieren Proteine für den Cbl-Stoffwechsel und den lysosomalen Cbl-Transport werden wir durch Überexpression bzw. Knockdown in Coenzymsyntheseassays und Cbl-Transportassays überprüfen. Wir erwarten, dass die Aufklärung des molekularen Mechanismus des lysosomalen Cbl-Transports Hinweise zur Aufklärung der Pathogenese häufigerer Erkrankungen wie M. Alzheimer und M. Parkinson liefert, bei denen ebenfalls lysosomale Transportmechanismen beeinträchtigt sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen