Massenspektrometer mit Quadrupol-Flugzeit-Analysator (Q-TOF) und Ionenmobilitätszelle (IMS), inkl. Option für "Elektronen-Transfer Dissoziation(ETD)"
Final Report Abstract
● Entwicklung von Methoden zur absoluten Protein-Quantifizierung und deren Anwendung zur Charakterisierung von plastidärem Protein-Import: Mit dem Synapt G2S Massenspektrometer haben wir Methoden zur absoluten Quantifizierung von Proteinen etabliert. Diese Verfahren sind auf Protein-Gemische aus allen biologischen Systemen übertragbar, so dass großes Interesse daran auch außerhalb der Pflanzenwissenschaften besteht. Mit den etablierten Methoden haben wir einzelne Aspekte der Chloroplasten-Biologie funktionell charakterisiert. In Analysen zum plastidären Protein-Import konnten wir zeigen, dass die N-terminale Aminosäure keinen direkten Einfluss auf die Transportfähigkeit eines Proteins in die Chloroplasten hat. Um die Spezifität von Rezeptoren zu charakterisieren, haben wir die Gesamtheit aller Proteine in Plastiden aus Wildtyp und verschiedenen Importmutanten quantifiziert. Hier zeigte sich, dass das aktuelle Modell zur Importspezifität der Rezeptoren an der äußeren Hüllmembran verworfen bzw. angepasst werden muss. Auf der Suche nach Determinanten der Import-Spezifität haben wir begonnen, cytosolische Faktoren systematisch mit in die Betrachtung zu integrieren. Möglicherweise spielt die Stabilität eines Proteins und damit die Dauer seiner Verfügbarkeit eine Rolle in der Spezifität des Protein-Importes. Unter Benutzung der Proteasom-Inhibitoren MG132 und Syringolin A untersuchen wir daher aktuell den Einfluss des Proteasoms auf die Assemblierung des Plastidenproteoms. Mittels absoluter Proteinquantifizierung konnten wir darüber hinaus Protein/Protein-Interaktionen an der äußeren Hüllmembran etablieren. Diese Analysen führten zur Entdeckung einer neuen Protein-Importkomponente des inneren Translokons (TIC), die wir aktuell biochemisch und physiologisch charakterisieren. ● Analyse posttranslationaler Modifikationen: Wir haben die Synapt G2S zur Detektion von posttranslationalen Modifikationen eingesetzt. Im Bereich der Phosphorylierung arbeiten wir aktuell mit Prof. Bassi (Verona) zusammen. Wir konnten zeigen, dass ein Protein des Lichtsammelkomplexes (Cp29) in dikotylen und monokotylen Pflanzen an unterschiedlichen Positionen phosphoryliert wird (Betterle et al., eingereicht). Darüber hinaus identifizieren wir aktuell das Substratspektrum der plastidären Kinasen STN7, STN8, pCKII und CSK über vergleichende Phosphoproteom Analysen zwischen Wildtyp und Kinase-Mutanten. Hierzu etablieren wir derzeit geeignete Scanverfahren wie z.B. ETD gekoppelt mit HD-DDA. Dank der hohen Sensitivität der Synapt G2S haben wir bisher nicht identifizierte Proteinkinasen in Heparin-Sepharose Chromatographie angereicherten Proteinfraktionen identifiziert. ● Weitere Kollaborationen: Darüber hinaus verwenden wir das Massenspektrometer in verschiedenen Kooperationsprojekten: mit Prof. Nies (Halle) zur Analyse des quantitativen Proteoms von Cupriavidus metallidurans; mit Prof. Klösgen (Halle) zur Bestimmung der Stöchiometrie des TAT-Translokons; mit Prof. Grimm (HU Berlin) zur Identifikation neuer Proteinkinasen in Chloroplasten; mit Prof. Hörtensteiner (Uni Zürich) zur Analyse von Proteinkomplexen in Chlorophyll- Katabolismus-Mutanten; mit Prof. Schmitz-Linneweber (HU Berlin) zur Identifikation von RNP Interaktionspartnern; mit Prof. Kessler (Uni Neuchatel) zur Identifikation von Substraten der ABC-Kinasen; mit Prof. Goldschmidt-Clermont (Uni Genf) zur funktionellen Analyse von plastidären Phosphatasen; mit Prof. Mock (Gatersleben) zur Identifizierung und Quantifizierung von Proteinprofilen aus Gerstenkörnern.
Publications
- (2014). Protein identification and quantification by data-independent acquisition and multiparallel collision-induced dissociation mass spectrometry (MSE) in the chloroplast stroma proteome. Journal of Proteomics 98, 79-89
Helm, S., Dobritzsch, D., Rödiger, A., Agne, B. and Baginsky, S.
(See online at https://doi.org/10.1016/j.jprot.2013.12.007) - (2014). The peptide microarray “ChloroPhos1.0” identifies new phosphorylation targets of plastid casein kinase II (pCKII) in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE 9(10): e108344
Schönberg, A., Bergner, E., Helm, S., Agne, B., Dünschede, B., Schünemann, D., Schutkowski, M. and Baginsky, S.
(See online at https://doi.org/10.1371/journal.pone.0108344) - (2014). The RNA-binding protein RNP29 is an unusual Toc159 transport substrate. Frontiers in Plant Sciences 5, 258
Grimmer, J., Rödiger, A., Hoehenwarter, W., Helm, S. and Baginsky, S.
(See online at https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00258)
