Charakterisierung der molekularen Protein-Interaktion zwischen dem SIAH1 und dem AF4 Protein durch NMR-Strukturaufklärung
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Hochrisiko-Leukämien bei Kleinkindern und Säuglingen sind häufig mit der chromosomalen Translokation t(4;11) assoziiert. Bei dieser reziproken Translokation werden die zwei Gene MLL (11q23) und AF4 (4q21) so miteinander rekombiniert, dass zwei Fusionsgene an den Chromosomenbruchstellen entstehen. Die dadurch kodierten Fusionsproteine setzen wesentliche Funktionen der beiden Wildtypproteine MLL und AF4 ausser Kraft. Im Verständnis darüber zu generieren, welche Konsequenzen die für betroffene Leukämiezellen hat, sollte in dem hier durchgeführten Projekt MA1876/8-1 die molekulare Interaktion zwischen dem AF4 Protein und den beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 untersucht untersucht werden. Dazu wurden Teile des AF4 Proteins rekombinant hergestellt und mit SIAH-Proteinfragmenten zunächst in Yeast-Two-Hybrid-Experimenter) untersucht. In diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der C-terminale teil der beiden SIAH Proteine mit einer kleinen Domäne des AF4 Proteins spezifisch interagiert. Parallele Studien, die währed dieser Teil publiziert wurden, zeigten dass SIAH Proteine das Sequenzmotiv PxAxVxP selektiv erkennen, binden und damit dem proteasomalen Abbau zuführen. In der von uns charakterisierten Domäne des AF4 Proteins findet sich ebenfalls dieses Sequenzmotiv. Eine Veränderung dieses Sequenzmotivs in PxAxNxN führt zu einer zellulären Stabilisierung des AF4-Proteins. Rekombinantes AF4 Protein oder davon abgleitete Peptide wurde in anschliesenden NMRStudien verwendet. Da eine Kristallstruktur von SIAH bereits seit 2002 bekannt ist, wurde rekombinant hergestelltes SIAH Protein an spezifischen Aminosäure-Positionen selektiv markiert (13C-Met, 15N-Phe). Die anschliessende Titration mit rekombinanten AF4-protein oder abgeleiteten Peptiden (NMR fast mapp/ng-Methode) führt zu spezifischen NMR-Peak- Veränderungen, aufgrund derer man erste Rückschlüsse auf den Bindungsmode des AF4 Proteins an SIAH ziehen kann. Auch die durchgeführten HNCO Experimente zeigen, dass AF4 über die beiden Methionine an Position 145 und 190, sowie Phenylalanin 165 an die Substratbindedomäne der SIAH Proteine binden kann. Damit wurde der Bindungsmodus von AF4 an das SIAH Protein aufgeklärt worden. Allerdings ist nach wie vor unklar, warum AF4-MLL diese Bindefähigkeit an SIAH Proteine verliert. Das leukämogene AF4-MLL Fusionsprotein besitzt das identische SIAH-Degron-Motiv, wird aber von SIAH Proteinen nicht mehr gebunden: das AF4-MLL Fusionsprotein wird durch Taspasel hydrolysiert, und bildet anschliessend eine hochmolekularen Proteinkomplex mit anderen Kernproteinen; dadurch verliert er seine Interaktionsfähigkeit mit beiden SIAH Proteinen und kann nicht mehr abgebaut werden. Weitere Arbeiten zu diesem Thema werden derzeit in unserem Labor durchgeführt.
