Bestimmung der Funktion von Lgd/CC2D1 in Maus

• Antragsteller: Professor Dr. Thomas Klein
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2019
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 188145095

Das Tumorsuppressorgen lethal (2) giant discs (lgd) codiert eine Komponente des endosomalen Wegs die für die Degradation von Transmembranproteinen durch den endosomalen Weg benötigt wird. Lgd interagiert mit Shrub (Shrb), der Kernkomponente des ESCRT-III Komplexes, einer von vier Komplexen, die zusammen intraluminale Vesikel (ILVs) in das Lumen von reifenden Endosomen (MEs) abschnüren. Dieser Schritt ist für die Degradation von Transmembranproteinen und der Termination der intrazellulären Signaltransduktion von aktivierten Rezeptoren essentiell. Der Verlust der Funktion von lgd führt zur unkontrollierten, Liganden-unabhängigen Aktivierung des Notch Signalwegs durch einen Defekt im endosomalen Transport des Notch Rezeptors. Der größte Teil der Untersuchungen der Funktion von Lgd im endosomalen Wegs ist bisher in Drosophila durchgeführt worden. Es existieren zwei Orthologe im Genome von Säugern, Lgd1/CC2D1B/FREUD-2 und Lgd2/Aki/CC2D1A/FREUD-1/TAPE. Ob sie ebenfalls eine Funktion im endosomalen Weg haben, war am Anfangs der Förderperiode nicht bewiesen. Wir haben dies durch die folgenden Arbeiten in der letzten Förderperiode gezeigt: Wir haben konditionale Allele von beiden Lgds in der Maus generiert und weiter daraus konventionelle Allele. Wir konnten bestätigen, dass Lgd2-mutante Tiere kurz nach der Geburt durch einen Atemdefekt sterben. Dies wird durch einen Defekt im Gehirn verursacht. Der Verlust der Lgd1 Funktion führte zu keinem sichtbaren Defekt und die mutanten Tiere werden in Homozygose gehalten. Mithilfe von Lgd1 oder Lgd2 mutanten MEFs konnten wir eine ähnliche Funktion für die Lgds zeigen wie vorher in Drosophila gefunden. Beide Lgds interagieren mit den drei Shrb Orthologen CHMP4a, b, c. Sie interagierten aber auch mit weiteren Mitgliedern der CHMP Familie, CHMP5 und CHMP7. Unsere funktionale Analyse der humanen LGDs in Drosophila zeigte, dass beide die Funktion von lgd ersetzen können. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Funktion von LGD1 und 2 in Metazoen konserviert ist und die beiden Proteine funktional redundant wirken. Um die Funktion von Lgd in Säugern zu bestimmen ist es also nötig beide Gene zusammen auszuschalten. Die Analyse der Doppelmutanten ist das Ziel der zweiten Förderperiode. Wir werden den Zeitpunkt des Todes während der Embryonalentwicklung bestimmen und die auftretenden Defekte analysieren. Mithilfe unserer konditionalen Allele werden wir die Konsequenzen des kompletten Ausfalls der Lgd Funktion im Darmepithelium untersuchen. Wir haben doppelt-mutante MEFs hergestellt, die wir nutzen um die zellulären Defekte zu untersuchen. In diesen Untersuchungen werden wir eine Kombination von Licht- und Elektronenmikroskopische, molekularbiologische und Immunohistochemische Techniken einsetzen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen