STORM/PALM Super-Resolution Mikroskopie System
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das ‘Custom-Built’ STORM/PALM System wurde innerhalb des SFB 958 Z02 Projektes geplant und kostengünstig aus Einzelteilen gebaut. Ziel war es nanoskalige zelluläre Membrangerüststrukturen mit erhöhter Auflösung gegenüber der herkömmlichen Mikroskopie in mehreren Farbkanälen darzustellen. Der Aufbau des STORM/PALM Systems verlief in mehreren Phasen. Nach dem Design und Planung (2010) wurde mit der Anschaffung der Einzelteile begonnen. Das System basiert auf einem hochauflösenden Forschungsmikroskop und einer selbstgebauten Laser- und TIRF-Einheit um maximale Laserleistungen zu gewährleisten. Die Steuerung des Systems wird kostengünstig mit ‘Open-Source Software’ betrieben. Dazu wurden alle Hardwarekomponenten in die Software integriert. Zur Zeit des Aufbaus des STORM/PALM Systems (2011) gab es nur wenige robuste multi-Farben Anwendungen in der Super-Resolution-Microscopy. Mit dem Ziel eine robuste Methode zur multifarben dSTORM Methode zu etablieren testeten wir verschiedene Kombinationen von Farbstoffen und Laseranregungsschemata. Wir entwickelten daraus das jetzt etablierte Multifarben ‘spectral-demixing’ dSTORM (SD-dSTORM) Technik, die auf der gleichzeitigen Anregung zweier order mehrerer Farbstoffe und der farblichen Trennung mittels eines dichroiden Spiegels im Emissionspfad geschieht. Unser speziell entwickelter Analysealgorithmus reduziert das Einzelmolekülrauschen, benötigt keinerlei zusätzliche Korrekturen der präzisen Viel-Farben-Überlagerung und ist effizient genug, um mehrere biologische Nanostrukturen mit niedrigem ‘color-crosstalk’ robust darzustellen. Weitere Optimierungen der Anwendbarkeit des Systems beinhalteten die Identifizierung von verbesserten Farbstoffkombinationen für SD-dSTORM, die Entwicklung von nutzerfreundlicher Software zur raschen Analyse von SD-dSTORM Daten, und die Entwicklung von 3-dimensionaler SD-dSTORM Analyse. Desweiteren haben wir die SD-dSTORM Auflösung durch die Identifikation neuer Farbstoffsysteme soweit erhöht, so dass die Ultrasstrukturen von einzelnen Synaptischen Vesikeln in Fluoreszenz sichtbar wurden. Laufende biologische Anwendungen beinhalten die nanoskalige Untersuchung der Clathrin-abhängigen Endozytosemaschinerie, der aktiven Zonen von Synapsen und von mechanosensitiven Elementen. In Zukunft wird das etablierte SD-dSTORM System vielseitig innerhalb der A-Projekte des SFB 958 und in Kollaboration mit anderen Institutionen zur Super-Resolution von nanoskaligen zellulären Strukturen angewandt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Multicolour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biol. Cell 104, 229–237 (2012)
Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M. & Schmoranzer, J.
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Spatiotemporal Control of Endocytosis by Phosphatidylinositol 3,4- Bisphosphate. Nature, 499, 233-237 (2013)
Posor, Y., Eichhorn-Grünig, M., Puchkov, D., Schöneberg, J., Ullrich, A., Lampe, A., Müller, R., Zarbakhsh, Gulluni, F., Hirsch, E., Krauss, M., Schultz, C., Schmoranzer, J., , Noe, F., Haucke, V.
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A Presynaptic Role for the Cytomatrix Protein GIT in Synaptic Vesicle Recycling Cell Rep. 7, 1–9 (2014)
Podufall J., Tian R., Knoche E., Puchkov D, Walter AM, Rosa S, Quentin C, Vukoja A, Jung N, Lampe A, Wichmann C, Böhme M, Depner H, Zhang YQ, Schmoranzer J., Sigrist S.J., Haucke V. et al.
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Nanometer-resolution fluorescence electron microscopy (nano-EM) in cultured cells Methods Mol. Biol. Clifton NJ 1117, 503–526 (2014)
Watanabe S, Lehmann M, Hujber E, Fetter RD, Richards J, Söhl-Kielczynski B, Felies A, Rosenmund C, Schmoranzer J, Jorgensen EM
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Novel organic dyes for multicolor localization-based superresolution microscopy. J Biophotonics. (2015) May 13
Lehmann, M., Lichtner G, Klenz H, Schmoranzer J
