Inhibition of Aortic Elastolysis by Adenoviral Gene Transfer of the Tissue-Inhibitor of Matrixmetalloproteinase-1 in Fibrillin-1 Deficient Gene Targeted Mice
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Marfansyndrom (MFS) ist eine seltene, heriditäre Erkrankung des Bindegewebes, welches mit der Inzidenz von 2 – 3 / 10000 Patienten vergesellschaftet ist. Im Vordergrund stehen bei diesen Patienten typische skelettale Veränderungen, so genanntes Linsenschlottern sowie Veränderungen an den Herzklappen und der Hauptschlagader. Insbesondere die Bildung von Aortenaneurysmen und konsekutiver Dissektion der Hauptschlagader reduzierten die Lebenserwartung von Marfanpatienten erheblich. Seit Einführung der prophylaktischen herzchirurgischen Operation der erweiterten Hauptschlagader ist die Lebenserwartung deutlich gesteigert. Dennoch ging man immer davon aus, dass eine vererbte Erkrankung wie das MFS nicht kausal behandelbar ist. Die für das MFS typischen molekularbiologischen Veränderungen liegen im Bereich des Fibrillin-1 Bindegewebes. Dieses Gewebe wird im Rahmen der sogenannten Elastolyse durch körpereigene Enzyme im Rahmen von Entzündungsprozessen verdaut, womit die Aortenwand an Stabilität verliert. Wesentliche Enzyme, die diesen Vorgang begünstigen, sind Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Diese werden wiederum von den Gewebsinhibitoren, den sogenannten TIMPs, neutralisiert. Beim MFS ist diese Balance zugunsten der proteolytischen Aktivität der MMPs aus dem Gleichgewicht geraten. Ein kausaler, therapeutischer Ansatz wäre also eine Erhöhung des TIMP-Anteils im Gewebe, so dass die Balance wieder hergestellt wird. In dem vorliegenden Forschungsprojekt sollte versucht werden, mit Hilfe von adenoviralem Gentransfer TIMP-1 in der Aortenwand beim Marfansyndrom zu überexprimieren. Ziel dieser Behandlung war die Reduktion der Elastolyse in der Aortenwand. Um diese Hypothese zu bestätigen, nutzen wir die mgR/mgR Maus, die durch eine genetische Veränderung als Marfanmodell akzeptiert ist. Hier wollten wir durch die Transplantation von Aortensegmenten, die vor der Implantation mit Adenoviren transduziert worden sind zur Überexpression vom TIMP-1, die Elastolyse reduzieren. Zunächst mussten die Strukturen für die Neuetablierung der mgR/mgR-Mauszucht in Heidelberg geschaffen werden. Im nächsten Schritt haben wir zunächst das mgR/mgR Modell charakterisiert. Nach Neuetablierung der Methode zur Genotypisierung haben wir die daraus resultierenden Ergebnisse mit dem Phänotyp der so identifizierten Mäuse verglichen. Wir konnten nachweisen, dass 49 von 50 Mäusen tatsächlich an einer Aortendissektion versterben. Die Mäuse zeigen das typische Bild eines MFS wie bei Menschen. Ferner beobachteten wir, dass mgR/mgR Böckchen eine ungünstigere Lebenserwartung haben als Weibchen. Im nächsten Schritt etablierten wir das Transplantationsmodell, im welchem vom Spendertier (mgR/mgR) die thorakale Aorta entnommen wurde, diese im Labor mit adenoviralen Vektoren, die für TIMP-1 kodierten, transduziert wurden, und dann in das Empfängertier (mgR/mgR) in die infrarenale Aorta implantiert wurden. 30 Tage nach der Operation wurden die Transplantate entnommen und histologisch und molekularbiologisch untersucht. Es zeigte sich, dass Marfanmäuse eine deutliche Elastolyse entwickeln. Nach Transduktion dieser Aorten mit Ad.Timp-1 wurde funktionelles TIMP-1 überexprimiert, und dadurch tatsächlich auch die Aktivität von Matrix MMPs reduziert. Tatsächlich aber mussten wir feststellen, dass die adenovirale Gentherapie mit TIMP-1 oder einem Kontrollvektor nicht zu einer Reduzierung der Elastolyse im Transplantat führte, sondern statt dessen die Behandlung mit adenoviralen Vektoren bei der Marfanmaus zu einer schweren Intimahyperplasie führte, also zu einer Verengung und Stenosierung des Gefässlumens der Aorta. Diese Beobachtung traf auf Mäuse ohne MFS nicht zu, diese Mäuse zeigten keine Intimahyperplasie. Damit mussten wir erkennen, dass der primäre Endpunkt unserer Untersuchungen, nämlich die Reduktion der Elastolyse, nicht erreicht wurde. Nun galt es, die zusätzliche Beobachtung der Intimahyperplasie zu erklären. Mit Hilfe von lichtmikroskopischen, elektromikroskopischen und molekularbiologischen Methoden konnten wir nachweisen, dass die innere Auskleidung der Gefäßwand, die Endothelschicht und Basalmembran, bei Marfanmäusen im Vergleich zu Wildtype Mäusen deutlich verändert ist. In einem Diffusionstest für Albumin konnten wir nachweisen, dass auch die Funktion der Endothelbarriere bei der Marfanmaus hochgradig gestört ist. Es ist bekannt, dass Endotheldefekte in der Gefäßwand zu schweren Entzündungsreaktionen führen, und fanden damit die morphologische und funktionelle Bestätigung, dass bei der Elastolyse beim MFS der Entzündungsprozess eine maßgebliche Rolle spielt. In einem Gemeinschaftsprojekt mit Prof. Dr Peter Robinson, Charité, Berlin, untersuchten wir die Wirkung des Entzündungshemmers Indometacin, einem weit verbreiteten Schmerz- und Entzündungsmedikament, auf die Entwicklung der Elastolyse bei MFS. Hier konnten wir tatsächlich belegen, dass die Aktivität von MMPs reduziert, die Elastolyse in der Aortenwand ebenfalls reduziert und der Entzündungsstoff Cycloxygenase II, der u.a. verantwortlich gemacht wird für die Entwicklung von Aortenaneurysmen, deutlich reduziert wird. Somit sind diese Ergebnisse ein Beleg dafür, dass der Entzündungsprozess in der Aortenwand beim MFS eine wesentliche Rolle im Pathomechanismus spielt. Dieses Wissen kann nun als Therapieansatz für das MFS genutzt werden. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um beim Menschen mit MFS diese Erkenntnisse in die klinische Anwendung zu bringen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- IndomethacinPrevents the Progression of Thoracic Aortic Aneurysm in Marfan Syndrome Mice. Aorta 2013;(1):5-12
Guo G, Ott CE, Grünhagen J, Munoz-Garcia B, Pletschacher A, Kallenbach K, V. Kodolitsch Y, Robinson PN
- The Fibrillin-1 HypomorphicmgR/mgR Murine Model of Marfan Syndrome Shows Severe Elastolysis in all Segments of the Aorta. J VascSurg, 2013;57(6):1628-36
Schwill S, Seppelt P, Grünhagen J, OTT CE, Jugold M, Ruhparwar A, Robinson PN, KarckM, Kallenbach K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1016/j.jvs.2012.10.007) - Die Maus als Modell für die Grundlagenforschung bei Marfan-Syndrom. Z Gefäßchirurgie 2014; 19(2):161-168
Schwill S, Robinson PN, Seppelt P, Karck M. Kallenbach K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00772-013-1294-6) - mgR/mgR-Maus Modell für die Gentherapie des Marfan-Syndroms. Z Herz-Thorax-Gefäßchirurgie, 2014; 28:222-224
Schwill S, Seppelt P, Robinson PN, Karck M, Kallenbach K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1007/s00398-014-1084-9) - Loss of endothelial barrier in Fibrillin-1 deficient Marfan mice (mgR/mgR) results in severe inflammation after adenoviral gene therapy. PLoS One, 2016 Feb 3;11(2): e0148012
Seppelt P, Schwill S, Arif R, Weber A, Zaradzki M, Richter K, Robinson PN, Wagner AH, Ensminger S, Karck M, Kallenbach K
(Siehe online unter https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148012)
