Zentrale Plattform für Live Cell Imaging und hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Seit der Inbetriebnahme des konfokalen Laserscanning-Mikroskops (LSM) im September 2011 wurde es in einer Reihe von wissenschaftlichen Arbeiten eingesetzt. Der Forschungsschwerpunkt am Lehrstuhl für Tierphysiologie ist die Untersuchung der Struktur und Funktion der Neuronen und ihrer Synapsen in der Säuger-Retina. In einem Projekt wurde mit Hilfe des LSM die Integrität von Horizontalzellen und ihrer synaptischen Verbindungen mit Photorezeptoren in einer horizontalen Slice-Präparation der Maus-Retina analysiert. Dieser Nachweis diente als Grundlage für alle im Projekt durchgeführten elektrophysiologischen Experimente. Im Rahmen eines weiteren Projekts zur Untersuchung der molekularen Zusammensetzung der Photorezeptor-Bandsynapse identifizierten wir Piccolino, eine für sensorische Neurone spezifische Spleißvariante des Synapsen-Proteins Piccolo. Mithilfe des LSM konnten wir das Vorhandensein von Piccolino an den Bandsynapsen der Photorezeptoren in der Retina und jenen der inneren Haarsinneszellen in der Cochlea nachweisen. Der Verlust von Piccolino führt zu strukturellen Veränderungen der Photorezeptor-Bandsynapsen, was wir unter anderem durch Fluoreszenzfärbungen und den Einsatz des LSM an freipräparierten intakten Retinae von Knockout Mäusen zeigen und analysieren konnten. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt am Lehrstuhl für Tierphysiologie ist die Untersuchung von Zilien. Zilien sind meist einzelne, unbewegliche Zellfortsätze, die auf nahezu allen Zelltypen von Wirbeltieren vorkommen können. Primäre Zilien sind an der Fortleitung von mechanischen und chemischen Signalen beteiligt, und Störungen der Zilienbildung führen zu sog. Ziliopathien. Sowohl in der Retina als auch im Riechepithel sind molekulare Signal-Transduktions-Kaskaden zur Wahrnehmung von Licht oder Duftreizen an das Vorhandensein eines Ziliums gekoppelt. Mutationen in Genen, die für Proteine kodieren, welche am Basalkörperkomplex oder direkt am Zilium lokalisiert sind, führen sehr häufig zu einer Degeneration des Zilienkomplexes und damit zu Blindheit und Geruchsstörungen. Eines dieser Proteine ist Pericentrin (Pcnt). Um mehr über die Funktion von Pcnt zu erfahren, wurden immunzytochemische Experimente mit Antikörpern gegen Pcnt und seinen möglichen Interaktionspartnern, die zuvor in einem Screen identifiziert wurden, in der Retina und in Zellkulturen durchgeführt und mit Hilfe des LSM analysiert. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Pcnt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und der Aufrechterhaltung von Zilien spielt. In Zusammenarbeit mit der Humangenetik untersuchen wir Zilien-Proteine in Hinblick auf humane Ziliopathien und auch hier kommt das konfokale LSM bei den hochauflösenden Strukturanalysen zum Einsatz. Intensiven Einsatz findet das konfokale LSM in der Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von Prof. Ralf Enz und Dr. Regina Dahlhaus (Institut für Biochemie). Veränderungen in der Struktur von Axonen und Dendriten können Störungen der neuronalen Signalweiterleitung nach sich ziehen und sind mit neurologischen Krankheiten, wie z.B. dem Fragilen X Syndrom (FXS) assoziiert. Molekulare Pathomechanismen des FXS basieren auf Signal-Kaskaden metabotroper Glutamatrezeptoren (mGluRs). In den letzten Jahren charakterisierten wir ein neues Protein mit dem Namen Simiate, welches eine Rolle in der neuronalen Morphogenese und damit potentiell auch im FXS und in mGluR assoziierten Signalwegen spielen könnte. In Neuronen des Hippocampus und der Retina ist Simiate in „nuclear speckles“ des Zellkerns lokalisiert, Kompartimente zur Steuerung von Transkriptions- und Spleiß-Vorgängen. Außerhalb des Zellkerns findet sich Simiate in dendritischen Fortsätzen, wo es mit Aktin und Septin kolokalisiert, die beide eine Rolle in der neuronalen Morphogenese spielen. Eine erhöhte Simiate Expression führt in hippocampalen Neuronen zu einer vermehrten Bildung und Verzweigung von Dendriten. Zusammenfassend ergaben unsere Studien Hinweise auf eine mögliche Funktion von Simiate als Transkriptions- und/oder Spleißfaktor im Zellkern sowie auf eine funktionelle Verknüpfung von Simiate mit Aktin und Septin während der Dendritogenese. Im Rahmen des ForIPS Projekts „Analyse von Neuriten und chemischen Synapsen von aus IPSZ generierten Vorläuferzellen und Nervenzellen“ findet das LSM seinen wichtigen Einsatz bei der hochauflösenden intrazellulären Lokalisation des Parkinson-relevanten Proteins α-Synuclein, bei Aktivitätsmessungen (Ca2+ Imaging) und bei Protein-Protein-Interaktionsstudien (FRET) in humaner neuronaler Zellkultur. Abschließend ist festzuhalten, dass das LSM maßgeblich zur erfolgreichen Durchführung von wissenschaftlichen Projekten am Lehrstuhl für Tierphysiologie und von Projekten im Rahmen von Kollaborationen mit Partnern aus der Medizinischen Fakultät, dem Klinikum und externen Partnern beigetragen hat.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One 8:e83007
Derlig K, Gießl A, Brandstätter JH, Enz R, Dahlhaus R
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(2013) Identification and immunocytochemical characterization of Piccolino, a novel Piccolo splice variant selectively expressed at sensory ribbon synapses of the eye and ear. PLoS One 8:e70373
Regus-Leidig H, Ott C, Löhner M, Atorf J, Fuchs M, Sedmak T, Kremers J, Fejtová A, Gundelfinger ED, Brandstätter JH
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(2014) In vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci 8:259
Regus-Leidig H, Fuchs M, Löhner M, Leist SR, Leal-Ortiz S, Chiodo VA, Hauswirth WH, Garner CC, Brandstätter JH
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(2014) Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborization of neurons. Front Mol Neurosci 8:99
Derlig K, Ehrhardt T, Gießl A ,Brandstätter JH, Enz R, Dahlhaus R
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(2015) DYNC2LI1 mutations broaden the clinical spectrum of dynein- 2 defects. Sci Rep 5:11649
Kessler K, Wunderlich I, Uebe S, Falk NS, Gießl A, Brandstätter JH, Popp B, Klinger P, Ekici AB, Sticht H, Dörr HG, Reis A, Roepman R, Seemanová E, Thiel CT
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(2015) Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur J Neuroscience
Babai N, Feigenspan A
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(2015) Special characteristics of the transcription and splicing machinery in photoreceptor cells of the mammalian retina. Cell Tissue Res
Derlig K, Gießl A ,Brandstätter JH, Enz R, Dahlhaus R
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(2015) Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells 4:500-519
Falk N, Lösl M, Schröder N, Gießl A
