Von Cyanobakterien zu Archaeplastida: Entschlüsselung der regulatorischen Vielfalt der PII Signalproteine
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Eine Variante des PII-Signalproteins aus dem Stamm "ynechocystis PCC 6803", welches zu einer starken Überaktivierung des Schlüsselenzyms der Arginin-Biosynthese führt, wurde dazu benutzt, einen rekombinanten Synechocystis Stamm zu konstruieren, der das Arginin-reiche Polymer Cyanophycin überproduziert. Bei den Studien des Cyanophycin-Stoffwechsels entdeckten wir auch die physiologische Funktion dieses Polymers: es erhöht die Effizienz der Stickstoff-Assimilation insbesondere bei Stickstoffarmen Bedingungen und bei schwankender Stickstoff-Versorgung. Weiterhin wurden maßgeschneiderte Varianten des PII Proteins entwickelt, die als FRET-Sensor für die Detektion des Metaboliten 2-Oxoglutarat verwendet werden konnten. Mit der FRET-Analytik gelang es auch nachzuweisen, dass die Interaktion zwischen PII und den Rezeptoren N-Acetyl-L-Glutamat Kinase oder des Transkriptionsfaktors PipX in erster Linie vom Energiegehalt der Zelle, gemessen am ATP/ADP Verhältnis, abhängt. Weitere Studien zur PII Regulation von PII zeigten, dass neben den bisher bekannten Interaktoren NAGK und PipX noch weitere zelluläre Funktionen duch PII gesteuert werden. Das erste diesbezüglich interagierende Ziel war das Schlüsselenzym der Fettsäurebiosynthese, die Acetly-CoA-Carboxylase, die durch Komplexbildung mit nicht phosphoryliertem PII inhibiert wird. In Abwesenheit der PII-Regulation kommt es daher zur Anreicherung von Lipiden. Um weitere PII Interaktoren zu identifizieren, wurden verschiedene Affinitäts-Reinigungen und Co-Präzipitationen durchgeführt und die mit PII angereichen Proteine mittels Proteomics identifiziert. Dabei erschienen Transportproteine für Stickstoff-haltige Substrate als herausragend angereichert, darunter Komponenten des Nitrat-ABC-Aufnahmesystems, des Harnstoff-Aufnahmesystems sowie der Ammoniumpermease AMT als stark angereichert. Die Spezifität dieser Interaktionen konnte mit komplementären Versuchen bestätigt werden. Bei diesen Analysen wurden auch weitere Peptide bislang unbekannter Funktion als PII Interaktoren identifiziert. In einigen pull-down Analysen wurde das Enzym PEP-Carboxylase (PEPC) als möglicher PII Interaktor identifiziert. PEPC ist entscheidend an der zellulären Fixierung von Carbonat beteiligt. Durch biochemische Studien konnte die Interaktion von PEPC mit PII bestätigt werden und die Regulation der PEPC Aktivität durch PII aufgeklärt werden. Schließlich konnte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Luciano Huergo auch Synthese von NAD in "Azospirillum brasiliense", als von PII gesteuerter Prozess, mittels Regulation der NAD-Synthetase, beschrieben werden. Die neuen Erkenntnisse zur cyanobakteriellen Signaltransduktion wurden jüngst in einem Review Artikel zusammen gefasst.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2015) Metabolic pathway engineering using the central signal processor PII. Microb Cell Fact. 14(1):192.
Watzer B, Engelbrecht A, Hauf W, Stahl M, Maldener I, Forchhammer K
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2015. Energy Sensing versus 2-Oxoglutarate Dependent ATPase Switch in the Control of Synechococcus PII Interaction with Its Targets NAGK and PipX. PLoS One. 2015 Aug 28;10(8):e0137114
Lüddecke, J. and Forchhammer K.
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2015. The bacterial signal transduction protein GlnB regulates the committed step in fatty acid biosynthesis by acting as a dissociable regulatory subunit of acetyl-CoA carboxylase. Mol Microbiol. 95:1025-1035
Gerhardt EC, Rodrigues TE, Müller-Santos M, Pedrosa FO, Souza EM, Forchhammer K, Huergo LF
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2016. Interaction of the Nitrogen Regulatory Protein GlnB (PII) with Biotin Carboxyl Carrier Protein (BCCP) Controls Acetyl-CoA Levels in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Frontiers in Microbiology
Hauf W, Schmid K, Gerhardt ECM, Huergo LF, Forchhammer K
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Lüddecke J, Francois L, Spät P, Watzer B, Chilczuk T, Poschet G, Hell R,. Radlwimmer B & Forchhammer K
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(2018) Cyanophycin Synthesis Optimizes Nitrogen Utilization in the Unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803, Applied and Environmental Microbiology. 84
Watzer, B. & Forchhammer, K.
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Watzer, B., Spät, P., Neumann, N., Koch, M., Sobotka, R., Macek, B., Hennrich, O.& Forchhammer, K.
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Forchhammer K. and Selim K.
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NAD+ biosynthesis in bacteria is controlled by global carbon/nitrogen levels via PII signaling. Journal of Biological Chemistry, Vol.295. 2020, Issue 18, pp. 6165-6176.
Schenberger-Santos, A.R, Gerhardt, E... and Forchhammer, K.
