From Cyanobacteria to Archaeplastida: Unveiling the functional diversity of PII signal transducers
Final Report Abstract
Eine Variante des PII-Signalproteins aus dem Stamm "ynechocystis PCC 6803", welches zu einer starken Überaktivierung des Schlüsselenzyms der Arginin-Biosynthese führt, wurde dazu benutzt, einen rekombinanten Synechocystis Stamm zu konstruieren, der das Arginin-reiche Polymer Cyanophycin überproduziert. Bei den Studien des Cyanophycin-Stoffwechsels entdeckten wir auch die physiologische Funktion dieses Polymers: es erhöht die Effizienz der Stickstoff-Assimilation insbesondere bei Stickstoffarmen Bedingungen und bei schwankender Stickstoff-Versorgung. Weiterhin wurden maßgeschneiderte Varianten des PII Proteins entwickelt, die als FRET-Sensor für die Detektion des Metaboliten 2-Oxoglutarat verwendet werden konnten. Mit der FRET-Analytik gelang es auch nachzuweisen, dass die Interaktion zwischen PII und den Rezeptoren N-Acetyl-L-Glutamat Kinase oder des Transkriptionsfaktors PipX in erster Linie vom Energiegehalt der Zelle, gemessen am ATP/ADP Verhältnis, abhängt. Weitere Studien zur PII Regulation von PII zeigten, dass neben den bisher bekannten Interaktoren NAGK und PipX noch weitere zelluläre Funktionen duch PII gesteuert werden. Das erste diesbezüglich interagierende Ziel war das Schlüsselenzym der Fettsäurebiosynthese, die Acetly-CoA-Carboxylase, die durch Komplexbildung mit nicht phosphoryliertem PII inhibiert wird. In Abwesenheit der PII-Regulation kommt es daher zur Anreicherung von Lipiden. Um weitere PII Interaktoren zu identifizieren, wurden verschiedene Affinitäts-Reinigungen und Co-Präzipitationen durchgeführt und die mit PII angereichen Proteine mittels Proteomics identifiziert. Dabei erschienen Transportproteine für Stickstoff-haltige Substrate als herausragend angereichert, darunter Komponenten des Nitrat-ABC-Aufnahmesystems, des Harnstoff-Aufnahmesystems sowie der Ammoniumpermease AMT als stark angereichert. Die Spezifität dieser Interaktionen konnte mit komplementären Versuchen bestätigt werden. Bei diesen Analysen wurden auch weitere Peptide bislang unbekannter Funktion als PII Interaktoren identifiziert. In einigen pull-down Analysen wurde das Enzym PEP-Carboxylase (PEPC) als möglicher PII Interaktor identifiziert. PEPC ist entscheidend an der zellulären Fixierung von Carbonat beteiligt. Durch biochemische Studien konnte die Interaktion von PEPC mit PII bestätigt werden und die Regulation der PEPC Aktivität durch PII aufgeklärt werden. Schließlich konnte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Luciano Huergo auch Synthese von NAD in "Azospirillum brasiliense", als von PII gesteuerter Prozess, mittels Regulation der NAD-Synthetase, beschrieben werden. Die neuen Erkenntnisse zur cyanobakteriellen Signaltransduktion wurden jüngst in einem Review Artikel zusammen gefasst.
Publications
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