HPLC gekoppeltes Tandemmassenspektrometer - Teilantrag 1
Final Report Abstract
Proteine sind die vielleicht wichtigsten molekularen Akteure in lebenden Systemen. Sie geben Körperzellen ihre Form und Struktur, sie katalysieren die chemischen Prozesse, die für die Aufrechterhaltung der Vitalfunktionen eines Organismus notwendig sind und sie steuern praktisch alle molekularen Vorgänge in Zellen. Die Zahl z. B. menschlicher Proteine (das Proteom) ist enorm hoch. Aus den ca. 20.000 Genen des Menschen lassen sich gut 100.000 verschieden Proteine ableiten, die ihrerseits jeweils in vielfältiger Weise während ihrer Lebensdauer abgewandelt werden können und dadurch zu einer erstaunlichen molekularen Vielfalt führen, die für die unüberschaubare Zahl von Proteinfunktionen in allen Lebensformen notwendig ist. Die HPLC-gekoppelte Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) ist die derzeit wichtigste analytische Basistechnologie in der Proteomforschung da sie es erlaubt, tausende Proteine sowohl qualitativ als auch quantitativ in einem Experiment zu erfassen und somit z. B. die Veränderungen der Zusammensetzung von Proteomen in unterschiedlichsten physiologischen oder pathologischen Situationen zu analysieren. Die konkreten Aufgaben des geförderten LC-MS/MS Systems bestanden in der Hauptsache in: a) der Messung von komplexen aus enzymatischem Verdau von Geweben oder Zellkulturen gewonnenen Peptidgemischen zur Identifikation der in diesen Geweben oder Zellkulturen vorhanden Proteine. Hierbei wurde neben der chromatographischen Trennung der Peptide, die Elektrospray-Ionisierung sowie die stoßinduzierte Fragmentierung der Peptide im Gerät eingesetzt. Aus den erhaltenen Fragmentionenspektren lässt sich über computergestützte Verfahren auf die Aminosäuresequenz des Peptids und somit auf die Identität des Proteins rückschließen. b) der Quantifizierung von Proteinen aus ebendiesen komplexen Mischungen. Hierbei bedient man sich der Tatsache, dass das massenspektrometrische Signal eines Peptids ein relatives Maß für seine Menge ist. Hierzu wurden sowohl Methoden der Stabilisotopenmarkierung, als auch sogenannte markierungsfreie Verfahren angewandt. c) der Analyse von post-translationalen Proteinmodifikationen. Proteine werden in Zellen auch nach ihrer Synthese vielfältig molekular abgewandelt, was oftmals von entscheidender Bedeutung für die Funktion der Proteine ist. Mit diesen Modifikationen gehen zumeist Veränderungen der Masse des Proteins einher, weshalb sich die Massenspektrometrie besonders für diese Anwendung eignet. Konkret wurden mit dem geförderten Gerät die Modifizierung von Proteinen durch Phosphorylierung und Glykosylierung untersucht. Das LC-MS/MS System über das hier konkret berichtet wird, wurde und wird in einer Vielzahl von grundlegenden sowie angewandten Forschungsprojekten in den Lebenswissenschaften eingesetzt. Das Anwendungsspektrum reicht hier von der Analyse von Protein-Protein Interaktionen in Pflanzen bis zur Kartierung des menschlichen Proteoms. Beispielhaft sind im folgenden einige Arbeiten skizziert in denen das Gerät konkret eingesetzt wurde: 1. So gelang es beispielsweise in Kooperation mit Pflanzenforschern der TU München, neue Proteine aufzuspüren, die die komplexen molekularen Vorgänge bei der Zellteilung orchestrieren. Dies gelang durch die biochemischen Aufreinigung von entsprechenden Proteinkomplexen aus Pflanzengewebe und der Identifikation und relativen Quantifizierung der darin enthaltenen Proteine durch die LC-MS/MS. Diese Arbeiten haben zu einem besseren Verständnis von grundlegenden Eigenschaften von Zellen beigetragen. 2. In Zusammenarbeit mit Medizinern des Universitätsklinikums der TU München konnte ausgehend von der Identifikation eines Rezeptorproteins durch die LC-MS/MS ein wichtiger molekularer Mechanismus aufgeklärt werden, durch den die Immunantwort des Menschen auf abgestorbene Körperzellen reguliert wird. Diese Erkenntnisse haben Implikationen für das Verständnis von entzündlichen Erkrankungen im Allgemeinen und Autoimmunkrankheiten im Speziellen. 3. Es zeigt sich immer mehr, dass sich die Darmflora entscheidend auf die menschliche Gesundheit auswirkt. In Zusammenarbeit mit Ernährungsforschern der TU München konnte durch LC-MS/MS gestützte Messungen gezeigt werden, dass sich die Zusammensetzung der Darmflora und damit das Metaproteom in Mäusen, die mit sehr fetthaltiger Nahrung gefüttert werden, stark von denen mit weniger fettreicher Nahrung unterscheidet und dies auch physiologische Folgen hat. Diese Erkenntnisse lassen sich möglicherweise zukünftig auch auf den Menschen übertragen und für die Gesundheitsförderung nutzbar machen. 4. Obwohl das menschliche Genom bereits seit über 10 Jahren weitgehend bekannt ist, war lange unklar, welche der aus dem Genom vorausgesagten menschlichen Proteine tatsächlich existieren. Innerhalb eines interdisziplinär zusammengesetzten Forscherteams konnte mithilfe von LC-MS/MS gestützten Hochdurchsatzmessungen erstmals eine Karte von Proteinen des Menschen erstellt werden. Diese Karte lieferte erste Antworten auf die grundlegenden Fragen, welche Proteine das menschliche Proteom enthält, wo die Proteine im Körper zu finden sind und in welcher relativen Menge sie dort vorkommen. Diese grundlegende Arbeit hat weitreichende Implikationen sowohl für die Grundlagenforschung als auch für das Verständnis von Krankheiten und die Entwicklung von Medikamenten. 5. Auch auf der technisch/methodischen Seite konnten wichtige Fortschritte erzielt werden. So gelang es mithilfe eines einfachen wie kostengünstigen Zusatzes einer gängigen Chemikalie, die Empfindlichkeit von LC-MS/MS Messungen um den Faktor 3-10 zu verbessern ohne dadurch die Kosten signifikant zu erhöhen. Dies bietet vielerlei Vorteile sowohl hinsichtlich der Anwendbarkeit auf geringe Probenmengen als auch der Steigerung des Probendurchsatzes.
Publications
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Plant Cytokinesis Is Orchestrated by the Sequential Action of the TRAPPII and Exocyst Tethering Complexes. Dev Cell 29, 607-620 (2014)
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