Phosphorylation of the transient receptor potential (TRP) ion channel in Drosophila vision

• Antragsteller: Dr. Olaf Voolstra
• Fachliche Zuordnung: Molekulare Biologie und Physiologie von Nerven- und Gliazellen
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2015
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 190739464

Der letzte Schritt der Phototransductionskaskade in Drosophila besteht in der Öffnung des transient receptor potential (TRP)-Ionenkanals. In vorangegangenen Arbeiten identifizierten wir 28 TRP-Phosphorylierungsstellen, von denen sich 27 in der intrazellulären C-terminalen Region befinden. Einige der C-terminalen Phosphorylierungs¬stellen, darunter T849, zeigen verstärkte Phosphorylierung im Licht, wohingegen die Stelle S936 als einzige verstärkt im Dunkeln phosphoryliert wird. Wir fanden eine Beteiligung der augenspezifischen Proteinkinase C (eye-PKC) an der Phosphorylierung von T849 und von retinal degeneration C (RDGC) an der Dephosphorylierung von S936. Die Mutation von T849 zu A, die eine Phosphorylierung verhindert, und die Mutation von S936 zu D, die eine Phosphorylierung nachahmt, führten beide zu einer verlängerten Deaktivierung der Lichtantwort in vivo. Vorläufige Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung der Phosphorylierung von S936 an der Lichtadaptation in Drosophila hin.Das vorgeschlagene Projekt soll die Rolle der TRP-Phosphorylierung an T849 durch eye-PKC und der Dephosphorylierung von S936 durch RDGC beleuchten. Wir werden eine transgene Fliege herzustellen, die einen modifizierten TRP-Kanal exprimiert, der sowohl den T849A- als auch den S936D-Austausch beinhaltet, um eine mögliche synergistische Regulation der Deaktivierung zu untersuchen. Wir werden außerdem eine Fliege herstellen, die einen TRP-Kanal exprimiert, in dem alle Phosphorylierungsstellen zerstört wurden. Die Mutation der Aminosäuren 849 und 936 zu T und S wird zudem zu T und S revertiert, um eine mögliche Rettung von Phänotypen zu untersuchen.Eine Voraussetzung für die Aktivierung von Vertebraten-PKCs ist die Phosphorylierung durch die PKC-Kinase und die folgende Autophosphorylierung an zwei weiteren Stellen. Diese drei Phos¬phorylierungs¬stellen sind in der Drosophila-eye-PKC konserviert. Wir möchten nun herausfinden, ob diese Stellen der Drosophila-eye-PKC phosphoryliert vorliegen. Wir werden transgene Fliegen herstellen, die eye-PKCs mit modifizierten Phosphorylierungs¬stellen exprimieren und die physiologischen Kon¬sequen¬zen der Modifikation der Phosphorylierungsstellen untersuchen. Außerdem werden wir nach neuen eye-PKC-Zielproteinen suchen.RDGC desphosphoryliert Rhodopsin an unbekannten C-terminalen Stellen. Wir werden die Rhodopsin-Phosphorylierungsstellen mittels Massenspektrometrie identifizieren. rdgC-Nullmutanten zeigen lichtinduzierte Retinadegeneration und eine verlängerte Deaktivierung der Licht¬antwort. Durch Expression eines C-terminal trunkierten Rhodopsins, das keine Phosphorylierungsstellen aufweist, und durch Expression von trpS936A werden wir die Einflüsse der TRP- und der Rhodopsin-Hyperphosphorylierung in einem rdgC-nullmutanten Hintergrund ent¬flechten.Das vorgeschlagene Projekt wird dazu beitragen, das Zusammenspiel von Kinasen und Phosphatasen bei der Regulation von Ionenkanälen besser zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen