Endosomale Sortierung der MHC Klasse I Moleküle

• Antragsteller: Professor Dr. Sebastian Springer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 190867601

Endozytische Sortierung von MHC-Klasse I-Molekülen Antigenpresentation durch MHC-Klasse I-Moleküle erlaubt es dem Immunsystem, infizierte oder tumorigen entartete Zellen zu erkennen. Die Anzahl der MHC-Klasse I/Peptid-Komplexe auf der Zelloberfläche wird mitbestimmt durch ihre Endozytose und lysosomale Degradation. Es ist bekannt, dass Zellen die drei Formen von MHC-Klasse I-Molekülen (schwere Kette, Dimer aus schwerer Kette und Beta-2 Mikroglobulin (der leichten Kette), und Trimer, d.h. Dimer plus Peptid) voneinander sortieren können (nur die schwere Kette allein wird degradiert), aber der molekulare Mechanismus dieses Sortierprozesses ist unverstanden. Seine Erforschung wird es ermöglichen, die T-Zell-Immunantwort besser zu erklären und zu manipulieren. Unsere Arbeitsgruppe ist besonders geeignet, um diese Frage zu untersuchen. Wir haben über zehn Jahre an der Qualitätskontrolle von Klasse I (im ER und Golgi) gearbeitet und kürzlich auch unsere erste Publikation über Endozytose veröffentlicht (FASEB J. 29 (2015), 2780). In diesem Projekt werden wir untersuchen - in welcher endozytischen Organelle die MHC-Klasse I Moleküle sortiert werden und, - welche zellulären Proteine diesen Sortierprozess bewirken. Dazu haben wir eine neuartige Tag-Probe-Methode zur in vivo-Markierung von Klasse I an der Zelloberfläche mit Fluorophoren oder Biotin entwickelt. Sie ist schnell (1 min), spezifisch, reversibel und unschädlich für die Zellen. Wir werden diese Methode verwenden, um den Transport von Klasse I durch die Organellen des endozytischen Wegs mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zu verfolgen und dann die Kolokalisation von Klasse I mit Rab-GFP-Fusionen und anderen Organellenmarkern zu überprüfen. Dazu werden wir auch spezifische Endozytoseinhibitoren verwenden. Außerdem werden wir Klasse I Moleküle mit fluoreszenzmarkierten Peptidliganden an der Zelloberfläche beladen und so den Zeitpunkt und den Ort der Trennung zwischen peptidgebundenen und peptidfreien Klasse I Molekülen bestimmen. Um die unbekannten Adaptorproteine zu identifizieren, die Klasse I-Sortierung bewirken, werden wir Klasse I an der Zelloberfläche mit Biotin markieren (s.o.), nach Endozytose mit Streptavidin-Beads präzipitieren und gebundene Proteine mit Massenspektrometrie identifizieren. Dabei werden wir die Formen von Klasse I getrennt untersuchen und die isolierten Proteine vergleichen. In einem parallelen Ansatz werden wir Regulatoren der Klasse I-Endozytose mit einem genetischen Screen identifizieren. Wir werden haploide Zellen mit Retroviren mutagenisieren und dann solche Zellen selektieren, deren MHC-Klasse I-Oberflächenmengen nach oben oder unten abweichen. Die Gene, die für diese Phänotypen verantwortlich sind, werden wir durch New Generation Sequencing identifizieren. Ihre Funktion werden wir durch dynamische In-Vivo-Assays von Recycling und Klasse I Degradation (die auf dem Tag-Probe-Labeling basieren) validieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen