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Projekt
Biochemie der Atmungskette in Dehalococcoides Stamm CBDB1
Antragsteller
Professor Dr. Lorenz Adrian
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung
Förderung von 2011 bis 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 171475307
Dehalococcoides mccartyi Stamm CBDB1 besitzt Chlorbenzol-reduktive-Dehalogenase Aktivität, die sich nach Zellfraktionierung in der Membranfraktion widerfindet. Die Aktivität ist in einem ca. 250 kDa großen Proteinkomplex lokalisiert. In vivo ist dieser Proteinkomplex an die Außenseite der cytoplasmatischen Membran gebunden, kann aber von dort durch milde Detergentien abgetrennt, partiell aufgereinigt und sensitiv durch Gelelektrophorese und Silberfärbung nachgewiesen werden. Seine Aktivität kann mit Hilfe von Viologen-Farbstoffen als artifiziellem Elektronendonor und Chloraromaten als Elektronenakzeptor quantifiziert werden, indem die Dechlorierung durch Photometrie oder gaschromatographische Analyse der Produkte gemessen wird. In diesem Vorhaben wird der reduktiv dehalogenierende Proteinkomplex in Bezug auf die Untereinheiten, aus denen er aufgebaut ist, seine Kofaktoren und seine Interaktion mit anderen Proteinkomplexen der Membran von Stamm CBDB1 charakterisiert. Dazu wird der Komplex zunächst über sukzessive Chromatographieschritte aufgereinigt und die einzelnen Untereinheiten über Massenspektrometrie quantifiziert. Über Blaue Native Gelelektrophorese wird dabei die Integrität des Komplexes nach jedem chromatographischen Schritt überprüft, während die Aktivität des Komplexes aus Gelstücken bestimmt wird, die aus dem Gel ausgeschnitten wurden und aus denen dann der Proteinkomplex eluiert wurde. Nach Präparation des Komplexes wird der Metallgehalt des Komplexes über induktiv gekoppelte Plasma Massenspektrometrie (ICP-MS) bestimmt. Diese Ergebnisse werden auch helfen, die Ergebnisse der Untereinheitenbestimmung und der Corrinoid-enthaltenden aktiven Untereinheit RdhA zu verifizieren. Die Stabilität des Komplexes wird in Salz- und Detergenzgradienten bestimmt werden. In einem zweiten Arbeitspaket dieses Vorhabens werden die Interaktionen der aktiven Untereinheit RdhA und dem putativen Membranankerprotein RdhB untersucht. Dazu werden invertierte Lipidvesikel hergestellt und das Ankerprotein RdhB integriert. Diese Vesikel werden dann verwendet, um die Stärke und Spezifität der Bindung zwischen RdhA und RdhB Proteinen zu analysieren, aber auch um den aktiven Proteinkomplex aus Rohextrakt direkt durch spezifische Bindung anzureichern. Diese Studien sollen schließlich Möglichkeiten aufzeigen, wie zusammen mit anderen Unterprojekten dieser Forschergruppe die komplette Atmungskette von Dehalococcoides mccartyi rekonstituiert werden kann.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
