Detailseite
Projekt
Regulation der Organohalidrespiration in Dehalococcoides mccartyi-Stämmen
Antragstellerin
Privatdozentin Dr. Ute Lechner
Fachliche Zuordnung
Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
Förderung
Förderung von 2011 bis 2018
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 171475307
Im beantragten Projekt soll die Transkriptionsregulation der multiplen, reduktive Dehalogenasenkodierenden Gene (rdh) in Dehalococcoides mccartyi untersucht werden. Zuerst soll eine Transkriptom-Analyse in enger Zusammenarbeit mit den Unterprojekten 1 (T. Goris) und 6 (M. von Bergen) durchgeführt werden. Wir werden RNA von Zellen liefern, die in Gegenwart und Abwesenheit von 1,2,3- oder 1,2,4-Trichlorbenzol inkubiert wurden, um Hinweise auf die Substanzspezifische Induktion der rdh-Gene zu erhalten. Im Anschluss an die 454-Sequenzierung von mit primären, unprozessierten Transkripten angereicherten cDNA-Bibliotheken (durchgeführt von C. Sharma, Würzburg), soll die Assemblierung und Datenanalyse in enger Zusammenarbeit mit den Partnern erfolgen, wobei unser Hauptinteresse der Identifikation von Transkriptionsstartpunkten von rdh und Regulator-kodierenden Genen gilt. Um Hinweise auf weitere Komponenten der regulatorischen Netzwerke in D. mccartyi zu erhalten, soll auch versucht werden, kleine RNAs und antisense RNAs zu identifizieren. Die rdh-Gene in D. mccartyi sind gewöhnlich mit Genen assoziert, die MarR-Typ- oder Zweikomponentensystem (TCS)-Regulatoren kodieren. Die Rolle des MarR-Regulators CbdbA1456 in der Transkriptionskontrolle der zwei assoziierten rdh-Gene cbdbA1455 und cbdbA1453 wurde im vorhergehenden Projekt nachgewiesen. Hier soll nun die Interaktion mit den Promotoren der rdh-Gene detailliert untersucht werden. Varianten von CbdbA1456 mit Aminosäureaustauschen in der vorhergesagten DNA-Bindestelle sollen durch ortsgerichtete Mutagenese produziert und hinsichtlich DNA-Bindung in vitro untersucht werden, begleitet durch in vivo Interaktionsstudien in Promoter-lacZ-Reporter-Stämmen. Die Strukturaufklärung der Bindung von Wildtyp- und Mutantenproteinen an die Ziel-DNA wird in Zusammenarbeit mit D. Leys, Manchester angestrebt. Das Vorkommen von N-Lysine-Acetylierung von Proteinen als möglicher regulatorischer Mechanismus soll in Zellen aus verschiedenen Wachstumsphasen von D. mccartyi in Zusammenarbeit mit Unterprojekt 6 (N. Jehmlich) untersucht werden. Ein weiteres Ziel ist die Untersuchung der Funktion des TCS, das aus der Histidinkinase CbdbA82 (HK) und dem Response-Regulator CbdbA83 (RR) besteht und vermutlich in die Transkriptionsregulation von cbrA, dem Gen der reduktiven Chlorbenzol-Dehalogenase involviert ist. Es sollen in vivo-Interaktionsstudien durchgeführt werden mit einem cbrA-Promoter-lacZ-Reporterstamm und Plasmiden, die für die TCS-Komponenten kodieren. Die Rolle weiterer möglicher Interaktionspartner wie der 70-Untereinheit der RNA-Polymerase soll ebenfalls adressiert werden. Mit Hilfe der heterolog produzierten HK und des RR sollen zum einen die Sensierung der Chloraromaten hinsichtlich der Stimulation der Autophosphorylierung der HK und zum anderen die Aktivierung des RR durch Phosphorylgruppenübertragung in Phosphorylierungs- Assays untersucht werden. Im Falle geringer Stabilität des phosphorylierten Histidins soll
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
