Regulation der substratabhängigen Expression und Aktivität von dehalogenierenden Enzymen in Dehalococcoides mccartyi strain CBDB1

• Antragsteller: Professor Dr. Martin von Bergen
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung von 2011 bis 2018
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 171475307

Die anaerobe reduktive Dehalogenierung von chlorierten organischen Molekülen ist ein wichtiger Teilprozeß im natürlichen Stoffkreislauf von halogenierten organischen Stoffen. Die Fähigkeit der Kopplung der reduktiven Dehalogenierung mit dem Energiegewinn (ATP) über die Atmungskette ist eine bemerkenswerte Eigenschaft der Art Dehalococcoides mccartyi. Über die biochemischen Vorgänge und deren Regulation ist bisher nur sehr wenig bekannt. Um die Physiologie des Modellorganismus Dehalococcoides mccartyi Stamm CBDB1 besser zu verstehen, wurde in der ersten Förderperiode ein Proteomkatalog erstellt. Diese Datenbank kann nun auch von anderen Gruppen weltweit für Datenbanksuchen verwendet werden, wodurch validere und schnellere Proteinidentifikationen erhalten werden. Des weiteren wurden zwei zielgerichtete Massenspektrometrie-basierte Techniken nämlich Selektive Reaktion Monitoring (SRM) und Precursor Reaction Monitoring (PRM) optimiert und für die absolute Quantifizierung von reduktiven Dehalogenasen (RdhAs) etabliert. In Kombination mit dem neu etablierten Proteogenomik Workflow, bei dem die Protein-kodierende Sequenzannotation verfeinert und neue translatierte Sequenzen und somit neue Proteine identifiziert werden können, werden wir in der zweiten Förderperiode auf diesen Arbeiten aufbauen und die Regulation der substratabhängigen Expression und Aktivität von dehalogenierenden Enzymen auf den verschiedenen Ebenen untersuchen. Auf der Ebene des globalen Proteoms werden wir die bisherigen Untersuchungen zur Proteinexpression unter verschiedenen Temperaturbedingungen (6°C, 10°C, 20°C, 30°C, und 40°C) und mit den Substraten 1,2,3-TCB und 1,2,4-TCB sowie bei Hexachlorbenzol-limitierenden Bedingungen erweitern. Hierdurch werden wir auch Informationen über die nur indirekt von den Substraten oder Kultivierungsbedingungen beeinflußten Proteine erhalten. Für die absolute Quantifizierung von 6 RdhAs werden die etablierten SRM/PRM-Methoden eingesetzt. Um die Regulierung der bereits analysierten Proteinexpression zu verstehen, wollen wir Transkriptomanalysen des Stammes CBDB1 unter drei verschiedenen Bedingungen (ohne Elektronenakzeptor, gewachsen auf 1,2,3-TCB und 1,2,4-TCB) sowie DCMB5 gewachsen mit 1,2,3-TCB durchführen (diese Arbeiten erfolgen in enger Zusammenarbeit mit SP 1, SP 2 und SP 3). Der dabei beteiligte MarR Regulator wurde bereits mit 6 Peptiden detektiert und wir werden auch die für die Funktionalität wichtigen posttranslationalen Modifikationen wie die Acetylierung dieses Proteins untersuchen. Auf der Ebene der reduktiven Dehalogenasen werden wir die Interaktion von reduktiven Dehalogenasen mit anderen Proteinen an und in der Membran mittels Crosslinking und Wasserstoff/Deuterium-Austausches (HDX) untersuchen, da gerade auch Protein-Protein-Interaktionen oftmals die Reaktivität der beteiligten Partner beeinflussen können.

• DFG-Verfahren: Forschungsgruppen
• Teilprojekt zu: FOR 1530: Anaerobic Biological Dehalogenation: Organisms, Biochemistry, and (Eco-)physiology
• Beteiligte Person: Dr. Nico Jehmlich